应用痰模型涂片法检测抗酸杆菌结果分析＊

2013-10-15刘庆福刘予东严秀丽邵德成

检验医学与临床 2013年4期

刘庆福，刘予东，严秀丽，邵德成

（1.山东省泰安市结核病防治中心参比实验室 271000；2.山东省泰安市泰山区疾病预防控制中心结核病防治科 271000；3.山东省泰安市宁阳县结核病防治所 271000）

痰涂片检测抗酸杆菌作为发现传染源、选择化疗方案、考核评价疗效的重要手段，在现代结核病控制工作中占有不可或缺的位置。就方法学而言，痰涂片抗酸染色检测抗酸杆菌并不复杂，关键是如何提高抗酸杆菌的阳性检出率，因此，加强痰标本采集、染色剂制备、涂片制备、染色、显微镜镜检、结果报告等环节的质量控制，特别是涂片制备是提高制片质量的关键环节之一。为了提高制片质量和抗酸杆菌阳性检出率，及时发现传染性肺结核患者，泰安市结核病防治中心刘庆福［1］带领的课题组研发出了痰模型涂片法检测抗酸杆菌，它通过对照玻片下面的标准膜，在玻片正面均匀涂抹成10mm×20mm椭圆形痰膜，有效控制了痰膜涂抹大小，从而实现了制片标准化，提高了制片质量和抗酸杆菌阳性检出率［1］。宁阳县结核病防治所2010年1月至2012年6月初诊的活动性肺结核患者，作为应用组应用痰模型涂片法检测抗酸杆菌，现将应用组检测结果与刘庆福等［1］报道的研究组检测结果对比分析如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源

1.1.1 应用组收集宁阳县结核病防治所2010年1月至2012年6月初诊的活动性肺结核患者，经临床、放射、检验医生会诊，挑选排菌可能性较大的肺结核患者为检测对象，如肺空洞、肺实变、支气管播散等患者共计260例，诊断标准见文献［2］。其中肺空洞21例，男11例，女10例，年龄17～72岁，平均（37±10.2）岁；肺实变67例，男32例，女35例，年龄19～81岁，平均（50±13.9）岁；支气管播散172例，男98例，女74例，年龄14～69岁，平均（36±12.7）岁。每位患者按要求留取当日即时痰、夜间痰、次日晨痰3份痰标本送检，共计780份，留痰前的健康教育由检验人员采用示范法［3］指导患者留痰，即语言加动作给患者示范漱口刷牙、轻咳弃去咽喉部异物、深吸气猛咳等整个留痰过程。当日即时痰为患者就诊时深咳出的痰液，次日晨痰为次日晨起后用力深咳出的痰液，夜间痰为当日晚至次日晨在夜间深咳出的痰液。

1.1.2 研究组收集泰安市结核病防治院、泰安市泰山区疾病预防控制中心在2010年1～12月初诊的活动性肺结核患者，经临床、放射、检验医生会诊，挑选排菌可能性较大的肺结核患者为研究对象，如肺空洞、肺实变、支气管播散等患者，诊断标准见文献［2］。其中肺空洞29例，男16例，女13例，年龄18～70岁，平均（39±11.5）岁；肺实变87例，男48例，女39例，年龄21～87岁，平均（52±14.6）岁；支气管播散247例，男129例，女118例，年龄16～73岁，平均（36±12.7）岁。每位患者按要求留取当日即时痰、夜间痰、次日晨痰3份痰标本送检，共计1 089份。留痰方法同应用组。

1.2 实验方法应用组与研究组实验方法完全相同。

1.2.1 模型涂片法涂片时将洁净的玻片放入旋转式抗酸杆菌涂片标准模型板玻片槽内，用折断的竹签茬端挑取痰标本的脓样、干酪样、黏液样等可疑部分约0.05～0.1mL，对照玻片下面的标准膜，在玻片正面均匀涂抹成10mm×20mm椭圆形痰膜。

1.2.3 染色镜检染色在旋转式抗酸杆菌涂片标准模型板上进行，往痰膜上加石碳酸复红溶液，加热至有蒸气出现，切不可沸腾，染5min，旋转90°弃去复红染液并用水冲洗干净，加3%的盐酸乙醇脱色至红色完全脱去，旋转90°弃去盐酸乙醇并用水冲洗干净，加亚甲蓝复染1min，旋转90°弃去亚甲蓝染液并用水冲洗干净。干后油镜读片，读片时从左向右观察相邻的视野，当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依次类推。

1.2.4 结果判断分级报告标准依据《中国结核病防治规划实施工作指南（2008年版）》［4］。抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌；报告抗酸杆菌菌数：1～8条抗酸杆菌／300视野；抗酸杆菌阳性（1＋）：3～9条抗酸杆菌／100视野；抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条抗酸杆菌／10视野；抗酸杆菌阳性（3＋）：1～9条抗酸杆菌／视野；抗酸杆菌阳性（4＋）：抗酸杆菌大于或等于10条／视野。

1.3 质量控制

1.3.1 室内质控新配制染色剂用泰安市结核病防治中心制备的已知结果的阳性和阴性质控片进行检测，质控片制备和染色剂检测方法见文献［5］；报告阳性结果由3名实验室工作人员同时确认，阴性结果由2名实验室工作人员同时阅片确认。

1.3.2 室间质控应用组、研究组均由泰安市结核病防治中心参比实验室盲法抽取痰涂片进行复检。应用组抽样方法：根据样本量表确定抽取痰涂片50张，抽样间距＝痰涂片总数780／抽片数50＝16，查随机数字表确定第一张涂片序号为5，在应用组780张痰涂片中，从第5号起，每间隔16抽取1张涂片，直到抽满50张。研究组抽样方法：根据样本量表确定抽取痰涂片80张，抽样间距＝痰涂片总数1 089／抽片数80＝14，查随机数字表确定第一张涂片序号为3，在研究组1 089张痰涂片中，从第3号起，每间隔14抽取1张涂片，直到抽满80张。

1.3.3 痰涂片质量控制标准痰细胞数平均大于或等于10个／视野，痰膜大小10mm×20mm±5%，痰膜厚薄每视野平均2～3层，痰膜脱落小于或等于10%痰膜面积，染色背景着色，痰膜呈均匀亮蓝色，无红色斑块。

1.3.4 阳性符合率和阴性符合率的计算公式阳性符合率（%）＝原始结果阳性数／复检结果阳性数×100；阴性符合率（%）＝原始结果阳性数／复检结果阳性数×100。

1.4 统计学方法模型涂片法应用组与研究组阳性检出率、痰涂片制备和染色合格情况比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 痰标本的性状应用组在送检的780份痰标本中，干酪痰、脓痰、血痰、黏液痰等合格标本724份，占92.82%，唾液、口水等不合格标本56份，占7.18%。研究组在送检的1 089份痰标本中，干酪痰、脓痰、血痰、黏液痰等合格标本1 036份，占95.13%，唾液、口水等不合格标本53份，占4.87%。应用组、研究组痰标本性状见表1。

表1 应用组、研究组痰标本性状

2.2 应用组、研究组模型涂片法制作的痰涂片镜检结果模型涂片法制作的痰涂片应用组阳性检出率为29.74%（232／780），研究组阳性检出率为31.68%（345／1 089），应用组比研究组阳性检出率低1.94%，无统计学意义（χ2＝0.799，P＝0.371），两组阳性检出率差异无统计学意义。应用组、研究组应用模型涂片法制作的痰涂片镜检结果见表2。

表2 两种痰涂片方法的镜检结果（n）

2.3 应用组、研究组模型涂片法痰涂片制备和染色情况应用组与研究组应用模型涂片法制作的痰涂片痰细胞、痰膜大小、厚薄、染色、痰膜脱落5项质量指标合格率均较高，两组痰涂片5项质量指标差异均无统计学意义（P值均大于0.05），差异无统计学意义。不同质量指标应用组、研究组痰涂片制备和染色结果比较见表3。

2.4 室间质控情况泰安市结核病防治中心参比实验室盲法抽取应用组模型涂片法制作的痰涂片50张，复检结果为定性、分级准确，原始结果与复检结果阳性符合率100.00%，阴性符合率100.00%，痰涂片质量符合国家标准。同时盲法抽取研究组模型涂片法制作的痰涂片80张，复检结果为定性、分级准确，原始结果与复检结果阳性符合率100.00%，阴性符合率100.00%，痰涂片质量符合国家标准。应用组、研究组模型涂片法制作的痰涂片原始结果与复检结果对照情况见表4。

表3 不同质量指标应用组、研究组痰涂片制备和染色结果比较

表4 应用组、研究组模型涂片法制作的痰涂片原始结果与复检结果对照情况（n）

3 讨论

痰涂片检测抗酸杆菌操作简单，快速、价廉，特异性较高，是最普及、最经济的方法，也是中小实验室和基层实验室的主要检验方法。但是目前开展的目测涂片法制片质量和阳性检出率低，这已是不争的事实，国内也有诸多相关报道［6］。要提高痰涂片检测抗酸杆菌的阳性检出率，留取合格的痰标本是前提，制作高质量的痰涂片是提高阳性检出率的关键［7］。从表1可以看出，应用组、研究组分别留取了92.82%、95.13%的合格痰标本，为提高阳性检出率打下了良好基础，在挑取痰标本可疑部分0.05～0.1mL的前提下，涂片时涂抹过大，可导致痰膜过薄，痰细胞数量过少，镜检时观察相同数量的视野，就会降低阳性检出率，反之，涂抹过小，导致痰膜过厚，继而引起染色不均，痰膜脱落，镜检模糊不清，也会降低阳性检出率。如何提高制片质量和阳性检出率，成为痰涂片检测抗酸杆菌亟待解决的问题，应用组应用刘庆福等研发的痰模型涂片法检测抗酸杆菌结果显示，模型涂片法可有效控制影响因素，提高制片质量和阳性检出率。

3.1 模型涂片法提高了阳性检出率从表2可以看出，应用组、研究组模型涂片法阳性检出率分别为29.74%、31.68%，均明显高于国内相关报道［8］。分析原因：一是为了评价模型涂片法检测抗酸杆菌的应用价值，挑选了初诊的活动性肺结核患者，即临床认为排菌可能性较大的肺结核患者为研究对象，这应该是提高幅度过大的主要原因［9］。二是检验人员示范法指导患者留取了合格的痰标本以及仔细挑取了可疑标本涂片；三是模型涂片法提高了阳性检出率。应用组应用结果显示模型涂片法有效控制了痰涂片检查抗酸杆菌的实验程序，提高了制片质量，从而提高了阳性检出率。

3.2 模型涂片法实现了涂片标准化模型涂片法是在挑取痰标本一定量（0.05～0.1mL）的前提下，对照玻片下面的标准模（10mm×20mm）涂抹，控制了痰膜的面积，既然痰量、面积都已固定，也就控制了痰膜厚薄，与此同时，由于痰膜厚薄适宜，也就提高了染色效果，避免了痰膜脱落，提高了制片质量。另外，可根据工作量大小制作数量不等的痰膜模型，在旋转式抗酸杆菌涂片标准模型板上染色，通过染色板旋转，实现了水洗同步，避免了痰片之间染色时间上的差异，大大提高了工作效率和染色效果［10］。

从表3可以看出，应用组与研究组应用模型涂片法制作的痰涂片痰细胞、痰膜大小、厚薄、染色、痰膜脱落5项质量指标合格率均基本一致，两者差异无统计学意义，说明该方法重复性好，精密度高，减少了人为误差，实现了涂片标准化。

3.3 模型涂片法制作的痰涂片符合国家标准痰涂片室间质控最重要的意义是保证检验质量的准确可靠。从表4可以看出，盲法抽取应用组与研究组应用模型涂片法制作的痰涂片，原始结果与复检结果的阳性、阴性和痰涂片5项质量指标都具有很高的符合率，各项指标均符合国家标准，说明模型涂片法的检测结果是准确可靠的。

总之，痰模型涂片法检测抗酸杆菌，实现了涂片标准化，提高了制片质量和阳性检出率，灵敏度高，重复性好，实用性强，简单易行，特别适合于基层实验室应用。

［1］刘庆福，刘予东，严秀丽.痰模型及目测涂片法检测抗酸杆菌的比较研究［J］.中国防痨杂志，2012，34（6）：364-368.

［2］王陇德.结核病防治［M］.北京：中国协和医科大学出版社，2004.

［3］中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程［M］.北京：中国教育文化出版社，2006，30-37.

［4］卫生部疾病预防控制局.中国结核病防治规划实施工作指南（2008年版）［M］.北京：中国协和医科大学出版社，2009，10-19.

［5］赵雁林，姜广路，夏辉，等.结核菌痰涂片显微镜检查标准化培训教材［M］.北京：人民卫生出版社，2009.

［6］陈中秀，谢清波，周风荣.聚集沉淀涂片与直接涂片抗酸染色法检测抗酸杆菌的应用比较［J］.中国防痨杂志，2009，31（4）：225-226.

［7］穆洮俊，司红艳，李睛，等.甘肃省结核病痰涂片省对县室间质量控制结果分析［J］.中国防痨杂志，2009，31（8）：457-460.

［8］李国红，苗润青，贾艳辉，等.1 284份痰标本分枝杆菌涂片镜检与培养结果分析［J］.中国防痨杂志，2011，33（8）：492-495.

［9］宋红焕，孟尔旺，时金艳，等.痰标本采集、储存及运输过程对培养结果影响的分析［J］.中国防痨杂志，2011，33（6）：372-376.