季铵盐联吡啶－钌（Ⅱ）配合物的合成及其与小牛胸腺DNA的相互作用

陈嘉曦，郝洪庆，黄大坤，黄丹梅，林海玲，孙 静＊

（1.广东医学院 药学院，广东 东莞523808； 2.嘉应学院 化学与环境学院，广东 梅州514015）

过渡金属配合物与生物大分子DNA键合机理的研究有助于开发与基因突变有关的新治疗药物、DNA结构探针等，成为生物无机化学研究领域的热点［1－4］.其中钌（Ⅱ）配合物因具有多变的光物理、光化学等性质以及在生物领域的应用引起了广大研究者的注意［5－6］.这些性质与配合物的结构有直接关系，改变或者调节配体的结构，如改变配体的平面性，平面的大小，配体的空间位阻以及增加配体的电荷能够很大程度上影响甚至改变配合物的性质.在这些因素中，配体的电荷和空间位阻在配合物与DNA作用中，扮演着重要的角色.我们通过前期的研究发现［7］，在位阻变化不大的情况下加大配体的电荷，有助于增加配合物与DNA之间的静电引力，从而增加它们之间的相互作用.三乙胺和三正丁胺配体“手臂”的尺寸较长，致使空间位阻过大而影响配合物的作用效果，因此我们选用三甲胺配体作为研究对象，减小配体的空间位阻，来研究配合物与DNA之间的作用.

1 实验部分

图1 钌（Ⅱ）配合物的结构图Fig.1 Molecular structure of the Ru（Ⅱ）complex

1.1 试剂和仪器

5，5′－二甲基－2，2′－联吡啶购自Sigma－Aldrich公司，5，5′－二（溴甲基）－2，2′－联吡啶以及配体5，5′－二（三甲铵基甲基）－2，2′－联吡啶溴盐 （LBr2·2H2O）的合成分别参照文献［8－9］进行；cis－Ru（phen）2Cl2·2H2O按照文献［10］制备.CT－DNA购自Sigma－Aldrich公司，三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）购自上海生工，其余均为市售分析纯试剂，用前未做进一步处理.配制缓冲溶液均用双蒸水，实验所用缓冲溶液为两种：（1）5mmol·L－1Tris和50mmol·L－1NaCl（pH＝7.2）的 Tris－HCl缓冲液；（2）1.5mmol·L－1Na2HPO4，0.5mmol·L－1NaH2PO4，0.25mmol·L－1Na2EDTA.紫外光谱、荧光光谱、CD（圆二色）光谱以及黏度等实验中的DNA母液，配合物母液及样品的配制均在缓冲溶液（1）中进行；热变性实验的配合物母液、DNA母液及所有样品的配制均在缓冲溶液（2）中进行.

元素分析 （C、H、N）采用Elementar Vario EL元素分析仪测定；电子吸收光谱用Perkin Elmer Lambda850紫外分光光度计；荧光光谱用Perkin Elmer Ls55荧光光谱仪；CD谱采用JASCO－J810圆二色谱仪记录.

1.2 配合物的合成

称取cis－Ru（phen）2Cl2·2H2O（0.28g，0.5mmol）和配体5，5′－二（三甲铵基甲基）－2，2′－联吡啶溴盐（0.26g，0.5mmol）溶于乙二醇，在氩气保护下130℃反应4h，冷却至室温后加少量水稀释，减压抽滤去未反应物，加入饱和NH4PF6溶液即产生大量红色沉淀.抽滤，沉淀分别用水、乙醚洗涤数次后干燥.然后将干燥好的粗产品过色谱柱，得到较纯的目标产物，产率72% .元素分析：实验值（%）：C 37.12，H 3.48，N 8.44；按C42H44N8P4Ru·H2O的计算值（%）：C 37.10，H 3.41，N 8.24.1H NMR（300MHz，d6－DMSO）：δ9.40（d，2H）；8.83（d，2H）；8.73（d，2H）；8.39（dd，6H）；8.30（t，2H）；7.90（dd，4H）；7.67（m，4H）；4.34（s，4H）；2.74（s，18H）.ES－MS：［CH3CN；m／z］＝1 197［M－PF－6］＋（60%），526［M－2PF－6］2＋（95%），302［M－3PF－6］3＋（100%）.

1.3 配合物与DNA作用的电子吸收光谱

在紫外－可见吸收光谱测定中，参比池放入3.0mL缓冲溶液，样品池放置相同体积的10μmol·L－1配合物溶液.用移液器每次向参比池和样品池同时加入相同体积DNA溶液，使DNA与配合物浓度比值 （cDNA／cRu）按一定的比例递增，混和均匀约5min后，在200～650nm的范围内监测配合物吸收光谱的变化.

1.4 配合物与DNA作用的荧光光谱

池中放入3.00mL钌（Ⅱ）配合物溶液 （10μmol·L－1），用移液器每次向样品池加入等体积的DNA溶液，使DNA与配合物浓度比值 （cDNA／cRu）按一定的比例递增，直至饱和.每次混和均匀约5min后，在500～750nm范围监测配合物的荧光光谱变化，用427nm光源激发，记录发射光波峰和发光强度.

1.5 配合物对DNA热变性的影响实验

DNA热变性实验用安装了Peltier PTP－6（±0.1℃）温控仪的Lambda－850紫外光谱仪来完成.配制含有10μmol·L－1配合物的100μmol·L－1的DNA溶液以及不含配合物的100μmol·L－1的DNA溶液，放入冰箱过夜，测试前先在测量的起始温度下恒温30min.用缓冲溶液扫基线，并用其相应浓度的配合物溶液作参比，测定在260nm处，DNA在配合物存在和不存在时，不同温度下的吸光度，温度范围为40～94℃，升温梯度为2℃，升温速度为1℃／min.

1.6 配合物与DNA作用的CD光谱

透析实验需要在常温避光条件下进行.取10mL配合物 （50μmol·L－1）溶液于小烧杯中，再取5mL CT－DNA（1.0μmol·L－1）溶液置于透析袋，然后把透析袋放在透析液中搅拌12h，取透析液进行CD光谱测定.

1.7 DNA黏度测试实验

黏度的测定采用乌氏黏度计，温度恒定在30±0.1℃.DNA的浓度固定不变，逐渐增加Ru（Ⅱ）配合物浓度配制溶液.相对黏度按下式计算：η＝ （t－t0）／t0.式中，t0为缓冲液流经毛细管所需的时间，t为DNA溶液（含不同浓度的配合物）流经毛细管所需的时间.以（η／η0）1／3对比r（r＝ ［Ru］／［DNA］）作图.η0为未加配合物时DNA溶液的相对黏度.

2 结果与讨论

2.1 配合物与DNA相互作用的电子吸收光谱

配合物与DNA的作用会改变配体所处的环境，光谱的变化则可反映结合的强弱.配合物与DNA作用的滴定吸收光谱如图2所示.与DNA作用后，配合物的MLCT峰红移了3nm，减色率为12.03%；位于紫外区292和262nm处的配体内部的LC跃迁和π－π＊跃迁峰的减色则要明显一些，分别为16.30%和44.38%.

为了定量比较配合物与DNA作用的强弱，通过紫外滴定光谱实验，以配合物在453nm处的吸光度变化，按下列方程计算出配合物与DNA作用的结合常数Kb.

图2 配合物与DNA作用后的紫外可见光谱图Fig.2 Absorption spectra of the complex interacted with CT－DNA

式中，［DNA］为 CT－DNA 的浓度，εf，εa和εb分别是配合物游离、与各浓度DNA结合时以及与DNA结合饱和时的摩尔吸光系数；ct为配合物总浓度，s为键合位点的大小，Kb为曲线拟合的结合常数.配合物与DNA结合的常数为（5.79±0.54）× 105L·μmol－1（s＝ 0.33±0.01），与之前所做的工作中两个配合物相比［7］，体现出较强的作用力，由于配体季铵盐离子都带有电荷，三甲胺配体较小的空间位阻就成为增加DNA与配合物之间作用力的重要因素.

图3 配合物与DNA作用的荧光强度变化图Fig.3 Emission spectra of the complex in buffer with increasing amounts of CT－DNA

2.2 配合物与DNA相互作用的荧光光谱

加入DNA后，若使钌（Ⅱ）配合物发出的荧光强度增加，则说明配合物与DNA发生某种方式的结合，荧光增强幅度的大小，一般能够反映配合物与DNA作用的强弱，但并不反映具体的结合模式.荧光的增强在于DNA保护了配合物，使它不受水分子的进攻.配合物的荧光滴定曲线见图3，在加入DNA后，配合物的荧光增强幅度为原来的2.81倍，说明配合物受到DNA很好的保护.而与文献［7］中两个配合物相比，荧光的增强规律与紫外并不完全相同，类似的现象也出现在我们另外的工作中［11］.我们推测，配合物较大的水溶性使部分荧光被淬灭，因而增强的程度并不大.

2.3 配合物对DNA热变性的影响

DNA的热变性经常被用来研究核酸与小分子配合物相互作用的稳定性大小，同时提供温度上升时DNA构象的变化和键合强度等信息.DNA在温度上升过程中，氢键遭到破坏，双链逐步解离成单链，一半DNA碱基解旋时对应的温度为DNA的熔点（tm）.变性时螺旋解开会造成原本藏于内侧的碱基外露，260 nm处的紫外吸收增加.当小分子与DNA以插入模式相结合时，由于能够和DNA碱基对之间发生π－π堆积作用，稳定DNA双螺旋结构，从而使DNA的熔点（tm）有明显升高［12］，而配合物与DNA之间仅仅通过简单的沟面结合、静电或氢键等弱结合时，Δtm变化则相对要小很多［9］.

图4给出了DNA在未加配合物前和加入配合物后的热变曲线，从图中可以得到DNA在缓冲溶液中的熔点为60.8℃，使 ［Ru］／［DNA］＝1∶10后，熔点升至84.2℃，升高幅度为23℃.熔点如此明显的升高表明配体phen极有可能与DNA的碱基发生了较强的π－π堆积作用，从而提高了CT－DNA结构的稳定性.

2.4 配合物与DNA作用的CD光谱

CD光谱可以对配合物在溶液中的手性物种提供有效的光谱信息.如果配合物的两种手性对应体与DNA的结合力相同，透析一段时间后，透析液中两种对应体的浓度相等，便没有CD信号出现；如果配合物的两种对映体与DNA的作用力不同，那么透析完成后，与DNA结合力较强的对映体在透析液中的浓度应较低，透析液具有旋光性，可以用CD光谱检测产生的诱导光谱ICD［13－14］.据文献报道［15－16］，配合物中右手螺旋的异构体由于合适的空间匹配性比左手螺旋的异构体更容易和具有右手螺旋结构的CT－DNA结合，所以配合物与DNA的立体选择性很容易通过CD信号得到.

配合物溶液与DNA经过透析实验后，透析液在紫外区的CD光谱如图5所示.从图中可以看出，配合物在230～350nm出现CD信号，255nm处出现一个正峰，268和297nm处出现两个负峰，这是典型的由立体选择性的手性异构体与DNA作用后所产生的ICD峰［17］.这表明，配合物对DNA具有很好的立体选择性，并且右旋异构体优先与DNA结合.

图4 DNA在无配合物和有配合物存在下的热变性曲线图Fig.4 Normalized UV melting curves of CT－DNA in the absence or presence of the complex

图5 配合物对CT－DNA透析液的CD光谱图Fig.5 CD spectra of the complex in the presence of CT－DNA

2.5 配合物与DNA的黏度测定

黏度测试作为检测配合物与DNA结合模式的最有效的方法之一，比光谱数据更有说服力［18－19］.当小分子配合物以经典插入方式与DNA作用时，DNA相邻碱基对的距离会变大来容纳插入配体，从而导致DNA双螺旋伸长，DNA溶液的黏度增加；而当配合物与DNA以部分插入方式作用时，就会使DNA的双螺旋链发生褶皱、弯曲、扭结，导致其相对黏度下降；此外，一些小分子如［Ru（bpy）3］2＋，主要以静电作用结合，DNA溶液的黏度则没有明显变化.

在配合物，对照物EB及［Ru（bpy）3］2＋存在下，DNA的相对黏度变化如图6所示.EB作为经典插入试剂，能使DNA双螺旋链的长度增加，从而使其相对黏度增加.而［Ru（bpy）3］2＋，主要以静电模式与DNA键合，则对DNA的黏度几乎没有影响.从图6可以看出，随着配合物浓度的逐渐增大，黏度先增加，后减小，然后又逐渐增加，这种结合模式明显不同于［Ru（bpy）3］2＋的静电结合，也不完全与半插入模式相同.由于配合物的特殊结构，季铵离子正电荷的存在，增大了它与DNA之间的静电引力，同时，热变性实验体现出较强的π－π堆积效应，我们推测两种模式都有，这两种作用之间的协同效应，增加了它们之间的作用力.

结论：利用紫外－可见吸收光谱滴定得到了配合物与CT－DNA作用的结合常数为5.79×105；荧光光谱滴定实验显示加入DNA后，配合物在缓冲溶液中的荧光强度增幅为2.81倍；热变性实验表明，在配合物的存在下DNA的熔点升高可达到20多度，说明配合物的配体与DNA之间存在较强的π－π堆积效应；并且这种作用可能是半插入和静电作用协同的结果.综上所述，配合物结构改变后，由于位阻的减小和配体电荷的存在，可以增加它与DNA之间的作用强度.

图6 配合物、EB和 ［Ru（bpy）3］2＋ 与CT－DNA作用后对黏度的影响Fig.6 Effects of increasing amounts of Ru，EB and Ru（bpy）2＋3on the relative viscosities of CT－DNA at 30±0.1℃，［DNA］＝0.5μmol·L－1，r＝ ［Ru］／［DNA］

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