两种分析miRNA相对表达量方法的比较研究＊

郑传浩，姚 磊，李 毅（第三军医大学新桥医院检验科，重庆 400037）

相对定量法广泛应用于实时反转录－聚合酶链反应（RTPCR）中，然而PCR产物的准确定量需要可用于数据分析的数学模型，目前2（－ΔΔCT）方法已经常规运用于实时 RT－PCR的相对定量分析，但是它没考虑PCR过程中的各种影响因素［1－5］。本文介绍了一种简便、准确的基因表达相对定量实时RT－PCR的GenEx软件分析方法，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 HK－2细胞系（本实验室提供）、3例健康者和3例乙型肝炎患者血清（已向患者交代血清的用途，并征求了患者的同意）。

1.2 方 法

1.2.1 最优PCR退火温度的选择 以HK－2细胞cDNA为模板，利用锐博生物购买的miR－16的PCR引物，按照TaKaRa TaqTM（DR001A）试剂说明书配制反应体系，分别设定4个重复管，进行退火温度为62℃、59℃、55℃、53℃的PCR反应，各反应温度设定2个重复管。然后通过20g／L琼脂糖凝胶电泳评价最适退火温度。

1.2.2 实时荧光PCR采用SYBR premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（Takara DRR420）试剂盒和相应miRNA引物（锐博生物提供）。20μL反应体系中含SYBR Green Mix 10 μL、cDNA 2μL、miRNA、Bulge－LoopTMmiRNA Forward Primer（锐博生物提供，62.5nmol／L）0.8μL 、Bulge－LoopTMmiRNA Reverse Primer（锐博生物提供，62.5nmol／L）0.8μL 、RNase－free H2O 6μL。在ABI StepOne仪器上按照如下顺序进行反应：95℃预变性2min，95℃变性10s，以得到的最优退火温度反应30s，循环40次。反应结束后立即行融解曲线分析，检测温度为70～95℃，升温速率为0.4℃／次，恒温时间为1分钟／次。

1.2.3 计算扩增效率 以10倍系列稀释的 HK－2细胞cDNA为模板，进行荧光定量PCR检测。由对数浓度值为横坐标，Ct值为纵坐标制作标准曲线。通过公式E＝10（－1／s）分别计算出miR－16和miR－122的扩增效率。式中E代表扩增效率，S代表标准曲线的斜率。

1.2.4 RNA的提取 收集3例健康者和3例乙型肝炎患者血清各1mL，将其分为500μL的2管，然后按照Trizol LS（Invitrigen）说明书操作，提取血清总RNA。

1.2.5 cDNA的合成 在无核酸酶污染的EP管中加入RNA 2μL，逆转录引物（锐博生物提供）1μL，按 M－MLV（Promega）的说明书操作合成cDNA。

1.2.6 数据分析 实验分别采用GenEx软件分析和2（－ΔΔCT）计算两种方法来进行miRNA相对定量分析。GenEx软件可通过http：／／www.qpcrforum.com／下载，将内参基因和目的基因的扩增效率和测定得到的Ct值输入该软件中，按软件说明进行操作，然后得到表达比值及统计分析结果。2（－ΔΔCT）分析是按照文献［2］提供的公式进行相应的计算。

2 结 果

2.1 最优PCR退火温度的选择 以HK－2细胞cDNA为模板，分别以退火温度为62℃、59℃、55℃、53℃来进行PCR。20g／L琼脂糖凝胶电泳发现，退火温度为55℃时，PCR扩增后的产量最多，图1。

图1 HK－2细胞系cDNA PCR扩增产物电泳图。

2.2 扩增效率的计算 以10倍系列稀释的HK－2细胞cDNA为模板，进行荧光定量PCR检测。由对数浓度值为横坐标，Ct值为纵坐标制作标准曲线。由图2可知，miR－16的斜率为－3.449，miR－122的斜率为－3.304，通过公式 E＝10（－1／s）可计算出 EmiR－16＝0.97，EmiR－122＝1.1。

图2 HK－2细胞cDNA经过荧光定量PCR后所得的扩增曲线及根据所得的Ct值绘制标准曲线。

2.3 miR－122基因相对定量分析

2.3.1 GenEx软件相对定量分析 按照实验分组，将相应的Ct值（表1）导入GenEx软件中，进行数据的预处理。把miR－16和miR－122的扩增效率：0.97和1.1的输入软件，就可轻松地得到其校正后的Ct值，见表2。设定miR－16为参考基因，miR－122为目的基因，然后软件可自动计算重复测定同血清来源miRNA的均值，然后进行相对定量分析最终得到乙型肝炎患者血清中miR－122的表达量是健康者的54.06倍，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 健康者和乙型肝炎患者qPCR结果

表2 健康者和乙型肝炎患者的E值校正后数据

2.3.2 2（－ΔΔCT）法数据分析 将表1的数据采用2（－ΔΔCT）法计算后，最终得到乙肝患者血清中miR－122的表达量是正常人群的44.30倍，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

总结以上实验数据，分别采用2（－ΔΔCT）法及GenEx软件分析来进行相对定量分析，用2（－ΔΔCT）得出乙型肝炎患者血清中miR－122的表达量是健康者的44.30倍，而采用GenEx软件分析为54.06倍，可见采用 GenEx分析的比值较2（－ΔΔCT）高。

3 讨 论

采用的实时RT－PCR技术进行基因表达分析包括绝对定量及相对定量法。由于研究者多关注目的基因的表达变化，即实验组与对照组的基因表达比值的变化。相对定量已经成为基因表达分析最常用的手段。但是目前大多数相对定量的研究都用于mRNA的水平上，对于 miRNA的研究还很少［6－8］，miRNA具有高度保守性、时序性和组织特异性，在逆转录的时候变异较小，本实验着重于miRNA的研究。用两种数据分析方法研究HBV患者血清相对于健康者血清中miR－122相对表达量的改变。

本文将2（－ΔΔCT）法与GenEx软件分析进行了比较，表明采用2（－ΔΔCT）法计算的表达比值比GenEx软件分析低10%，最好采用GenEx软件分析。

目前市场上销售的荧光定量PCR仪如Stratagene公司、Life Technology公司等多采用的2（－ΔΔCT）相对定量法。因其将PCR的扩增效率设定为1，但实际的扩增效率不可能达到1，因此该法计算出的相对定量结果通常不太精确［9］。GenEx软件是专门设计用于实时RT－PCR技术相对定量基因表达分析，其考虑了各方面的因素，因此相对于2（－ΔΔCT）的方法来说具有更高的精确度。总之，GenEx软件分析较2（－ΔΔCT）法更适用于相对定量的数据分析。

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