山楂叶总黄酮对糖尿病肾病大鼠肾脏中VEGF表达影响

2013-10-09刘中柱卢文婷

黑龙江医药科学 2013年6期

刘中柱，卢文婷

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154003)

糖尿病是一种常见的慢性病，发病率在我国呈逐年上升的趋势。而糖尿病肾病为糖尿病的全身微血管合并症之一。国外报道糖尿病人比非糖尿病人其心血管病和脑血管病的发生率高2倍以上，肾脏病的发生率则要高17倍以上[1]。近年来从不同角度的研究说明糖尿病肾病是多种内在关联因素参与及影响的结果，已知的有肾组织糖脂代谢、血流动力学、血压、肾小球滤过屏障、氧化应激性、遗传学因素、血管活性物质以及细胞因子和化学趋化因子等异常均能影响该病的发生发展。既往已有的实验研究证明[2]高血脂在肾脏病的发生中起明显作用。导致动脉粥样硬化的重要危险因素之一是低密度脂蛋白和氧化低密度脂蛋白，血管内皮细胞生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)也起着不可忽视的作用。由此可见VEGF可能也是脂质肾毒性的重要介质之一。山楂叶总黄酮(flavonoidsin hawthorn leaves，FHL)具有调节血脂的作用[3]。本实验研究了FHL对糖尿病肾病伴高脂血症大鼠血VEGF表达的影响及机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型建立

实验选用2～3月龄，体重180～220g的雄性SD大鼠48只(购自大连医科大实验动物中心许可证号SCXX(辽)2008－0002)。适应性喂养1周后，随机分为正常对照组(A组)、糖尿病肾病模型组(B组)和山楂叶总黄酮治疗组(C组)，每组16只。

1.2 实验方法

B组和C组大鼠一次性腹腔注射1%链脲佐菌素65mg/kg(购自Sigma公司，溶解于10mmol/L枸橼酸缓冲液中)，48h后连续 3d尾静脉测血糖，以连续 3次血糖≥16.8mmol/L，24h尿蛋白排泄≥3mg作为确定糖尿病肾病模型成功建立[4]的依据。模型建立后适应性喂养1周，大鼠未出现死亡，即C组开始按200mg/kg·d体重灌胃给药山楂叶总黄酮，A组和B组给予等量的生理盐水，共用时12周。生化指标测定:使用Olympus Au100全自动生化仪测定。放射免疫测定尿蛋白含量。免疫组织化学检测试剂盒购自武汉博士德公司。

1.3 统计学分析

2 结果

(1)第4、8、12周各组大鼠体重、血糖测定，见表1。实验期间A组大鼠体重和血糖相对稳定;B型组体重相对于A组明显下降且出现先升高后下降的现象，血糖相对于A组明显增高(P＜0.05);C组体重相对于B组有明显改善，且随时间的延长有所增长(P＜0.05)。

表1 4周、8周和12周各组大鼠体重和血糖(±s，n=4)

*与对照组比较，P＜0.05;#与模型组比较，P＜0.05。

测量指标时间(周) A组 B组 C组体重(g) 4 284.50±18.57 173.50±7.19* 184.0±7.30*306.00±21.60 181.00±7.02* 205.25±8.77*#12 334.50±34.35 178.25±10.4* 226.50±8.54*#血糖(mmol/L) 4 6.03±0.56 27.08±1.32* 25.98±1.08*86.23±0.43 26.25±0.68* 20.38±1.17*#12 6.28±0.61 26.73±1.09* 16.60±1.46*#8

(2)第4、8、12周各组大鼠血尿素氮和肌酐含量测定，见表2。A组相对稳定，B组和C组的第4周和第8周大鼠尿素氮和肌酐显著高于A组(P＜0.01)，C组经治疗后尿素氮、肌酐含量在第4周开始下降，随治疗时间的延长而显著下降，C组大鼠12周后尿素氮、肌酐含量与A组无太大差异(P ＞0.05)。

表2 4周、8周和12周各组大鼠尿素氮和肌酐含量(±s，n=4)

*与对照组比较，P＜0.05;#与模型组比较，P＜0.05。

测量指标时间(周) A组 B组 C组尿素氮 (mmol/L) 4 7.48±0.83 16.08±1.48* 13.18±1.39*#5.93±1.42 17.40±2.46* 10.20±1.53*#12 7.38±1.87 16.65±1.97* 9.58±2.53#肌酐(μmol/L) 4 60.4±2.59 95.18±3.41* 82.33±9.62*#860.63±1.36 98.13±8.24* 81.58±10.60*#12 60.80±2.15 117.65±12.29* 73.85±11.478#

(3)第4、8和12周时各组大鼠静脉血中胆固醇、甘油三酯、高、低密度脂蛋白含量，见表3。

A组在整个实验过程中血脂各项所测指标均处于相对稳定状态。在第4周和第8周时B组和C组大鼠静脉血中胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白明显高于 A组(P＜0.01)。治疗12周后，C组大鼠静脉血中胆固醇、甘油三酯含量显著低于 B组，且与A组差异无显著性(P＞0.05)。第4周和第8周时，B组和C组大鼠静脉血中高密度脂蛋白含量显著低于A组(P＜0.01)。C组经过12周灌胃治疗后，该组大鼠静脉血中高密度脂蛋白含量显著升高，相对于B组具显著性差异(P＜0.01)，且与A组无差异。第4、8和12周，B组和C组大鼠静脉血中低密度脂蛋白显著高于A组(P＞0.05)，且C组大鼠静脉血中低密度脂蛋白显著低于B型组(P＜0.01)。

表3 4周、8周和12周各组大鼠血脂胆固醇、甘油三酯、高、低密度脂蛋白含量(±s，n=4)

*与对照组比较，P＜0.05;# 与模型组比较，P＜0.05。

血脂系列时间(周) A组 B组 C组胆固醇(mmol/L) 4 1.24±0.22 2.01±0.24* 1.73±0.17*8 1.15±0.24 2.53±0.15* 1.55±0.07*#12 1.14±0.2 2.70±0.2* 1.37±0.14#甘油三酯(mmol/L) 4 0.84±0.4 2.35±0.29* 1.91±0.17*8 1.04±0.28 2.44±0.42* 1.25±0.18*#12 0.96±0.27 2.40±0.49* 1.18±0.21#高密度脂蛋白(mmol/L) 4 2.32±0.21 1.12±0.08* 1.17±0.15*8 2.53±0.14 1.15±0.2* 1.28±0.16*12 2.50±0.16 1.20±0.24* 2.20±0.25#低密度脂蛋白(mmol/L) 4 1.55±0.22 5.44±0.22* 4.11±0.33*#8 1.52±0.27 5.58±0.47* 3.33±0.21*#12 1.56±0.0 5.51±0.24* 2.32±0.55*#

(4)第4、8、12周各组大鼠24h尿蛋白测定，见表4。A组大鼠24h尿蛋白排泄率在实验期间无显著变化。第4、8周B组和C组大鼠24h尿蛋白显著高于A组(P＜0.01)，但C组经灌胃给药山楂叶总黄酮治疗后，在第4和8周时尿蛋白呈下降趋势，且含量显著低于B组(P＜0.05)。第12周后，C组大鼠尿蛋白仍然高于A组，但相对于A组无显著差异(P ＞0.05)。

表4 4周、8周和12周各组大鼠尿蛋白含量(±s，n=4)

*与对照组比较，P＜0.05;# 与模型组比较，P＜0.05。

检测指标时间(周) A组 B组 C组尿蛋白(mg/24h) 4 0.68±0.32 5.20±0.67* 3.47±0.59*#8 0.83±0.23 6.79±1.31* 3.46±0.90*#12 0.68±0.23 7.36±2.05* 1.30±0.81#

3 讨论

国内外研究已经证实[5]，LDL在AS发病过程中起到极为重要的作用，而其与肾小球硬化与系膜细胞增殖和增生的作用值得深入研究。系膜细胞表明有LDL受体，它可摄取LDL。LDL在肾小管和肾间质沉积可造成肾小球和间质的病理损害。还可进一步被氧化修饰成氧化型LDL，后者可使受损的内皮细胞释放生长因子和细胞因子，如刺激VEGE、PDGE和TGF－β1等的表达与分泌，导致系膜细胞增生及细胞外基质合成分泌增加。有研究显示[6～8]在早期糖尿病中存在有脂代谢紊乱的现象，随着病程的进展，血脂紊乱愈加明显。糖尿病肾病患者随着微量蛋白尿的出现即有TG和LDL的升高。伴随着肾脏损害加重，大量蛋白尿的排出，血脂紊乱进一步加重，提示脂代谢紊乱与糖尿病肾病关系密切。

血管内皮功能障碍在糖尿病肾病肾脏病变发生及发展中起着明显作用，多种因子参与这个过程，其中血管内皮生长因子的作用在糖尿病肾病微血管病变的发生过程中已被证实。研究表明[2]，糖尿病肾病患者肾小球内皮细胞损伤和功能紊乱的发生与VEGF密不可分并受其介导。VEGF通过改变内皮细胞的结构和功能，增加肾小球毛细血管通透性，促进细胞外基质合成、肾脏肥大等基质参与糖尿病肾病的发生与发展。

山楂叶是一种中药，具有味酸，性平，入肺经等特点。目前研究发现山楂叶化学成分的主要成分是黄酮类。有实验研究发现[3]FHL可明显降低糖尿病小鼠血清中血糖、总胆固醇、甘油三酯水平，呈剂量效应关系，并可以改善糖尿病引起的肾脏组织脂肪积累。本研究表明山楂叶总黄酮能明显降低患者体内尿蛋白，血肌酐和尿素氮的含量，有效改善肾功能。并通过改善肾小管结构，减少EMC积聚，有效延缓糖尿病肾病大鼠的肾脏组织病理学损伤。山楂叶总黄酮同时可以逆转糖尿病肾病引起的大鼠脂代谢紊乱，说明山楂叶总黄酮能调节血脂代谢紊乱，进一步可以降低高血脂对肾脏内皮细胞的刺激，下调VEGF表达和分泌，从而改善系膜细胞增生并延缓肾小球硬化。

本文实验结果提示山楂叶总黄酮治疗后，C组临床生化观察指标较模型组明显改善，肾组织病理检查也明显减轻。免疫组化示VEGF表达与模型组相比下降，说明山楂叶总黄酮对糖尿病肾病大鼠的肾脏具有一定的保护作用，与既往文献报道相一致。糖尿病肾病大鼠早期应用山楂叶总黄酮可降低糖尿病肾病大鼠的血脂从而能减轻尿蛋白排泄以及下调VEGF表达，阻碍基底膜增厚，提示山楂叶总黄酮是一个新的保护肾脏，延缓糖尿病肾病发展的方法与途径。

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