AQP3在人非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

王凤玲，张小霞，蔡栋梁

(佳木斯大学附属第一医院老年病科，黑龙江佳木斯154003)

近年来，肺癌在我国乃至全世界的发病率和死亡率已经跃居恶性肿瘤的首位，其中非小细胞肺癌(non－small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌总数的85%，其5年生存率仅16%，严重威胁着人类的健康。然而由于肺癌早期症状表现不明显，往往错过最佳诊断和治疗时机，发现时大部分已处于中晚期，失去了手术机会，因此改进肺癌的诊治水平，提高患者的生存率，对改善患者预后和增加生存率具有重要意义。水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一组参与跨细胞膜转运水的膜通道蛋白家族，根据其通透性的不同又分为水通道和水－甘油通道两个亚族，AQP3属于后者，通透水及其他小分子物质如甘油、尿素等，在液体稳态中发挥着重要作用。目前已有研究证实，AQP3在多种不同来源的肿瘤中表达水平较高，尤其是在侵袭性强的肿瘤中。但 AQP3在肺癌中的研究甚少，本课题采用免疫组织化学方法和酶联免疫法(ELISA)检测AQP3在非小细胞肺癌中的表达特性，探讨其在肺癌发生、发展中的作用及其作为诊断和治疗肺癌的新的分子靶点的潜在可能性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

取2012－02～2013－06期间佳木斯大学附属第一医院收住的非小细胞肺癌手术患者术后组织标本和血清标本各42例为实验组，20例癌旁组织(距癌肿超过5cm以上的正常肺组织)及20例健康体检者血清为对照组。非小细胞肺癌患者男24例，女18例;年龄36～87岁，平均(63±11)岁;腺癌22例，鳞癌20例;TNM分期:I、II期26例，III期16例;组织病理类型:高、中分化19例，低分化23例。入选标准:所选患者均为首次手术且达到完全性切除并经病理学确诊，术前均未接受放化疗，1个月内未接受全身或局部激素治疗，未应用过抗肿瘤药物，排除合并有哮喘、肺囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病及不动纤毛综合征等其他肺部疾病的患者。均经患者家属知情同意。

1.2 主要试剂

兔抗人AQP3多克隆一抗，免疫组化染色试剂盒，人水通道蛋白－3 ELISA试剂盒，所需试剂均购自天津索罗门生物技术有限公司。

1.3 实验方法

①将待测标本统一切成4μm厚石蜡切片，其中每份标本备2张切片行常规HE染色及免疫组织化学染色。②NSCLC患者在手术治疗前抽空腹静脉自凝血2mL室温静置1h，离心(5000r/min)，分离血清，冷冻保存，集中用ELISA法测血清中AQP3的浓度。各步骤严格按照检测试剂盒说明进行。

1.4 结果判定

①免疫组化SP法:由两位有经验的病理科医师对染色结果进行评判。以细胞膜或(和)细胞质出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性染色。参照Ozdemir等的评分标准，按染色强度和染色细胞百分数进行评分，其中染色强度评分标准:浅黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分;染色细胞百分数评分标准:染色细胞＜1/3为1分、1/3～2/3为2分、＞2/3为3分。每张切片染色程度与染色细胞数得分相乘为其最后得分，得分＜1为阴性，1～3为弱阳性(+)，4～6为中阳性(++)，7～9为强阳性(+++);表达程度的划分界限:(－)及(+)为阴性表达，(++)及(+++)为阳性表达。②免疫吸附实验:根据AQP3的标准品浓度及其对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线，再根据样品的OD值计算出相应的的样品浓度。

1.5 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件。计数资料两组间比较采用χ2检验，计量资料采用两样本t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

图1 AQP3在鳞癌中的表达(SP×400)

图2 AQP3在腺癌中的表达(SP×400)

2 结果

2.1 AQP3在非小细胞肺癌患者肿瘤组织中的表达

实验组患者的肿瘤组织标本阳性表达30/42例，阳性率为71.43%，对照组阳性表达6/20例，阳性率为30%，两者之间的差异具有显著统计学意义(P＜0.05)。

2.2 AQP3在非小细胞肺癌患者血清中的表达

血清AQP3的表达在实验组患者组为(3.53±1.39)ng/L，而对照组为(2.80±1.07)ng/L，实验组表达量明显高于对照组，两组间差异具有显著统计学意义(P＜0.05)。

2.3 AQP3在不同病理因素非小细胞肺癌患者的癌组织内和血清中的表达

AQP3在非小细胞肺癌组织中的表达水平与肺癌患者的性别、年龄、吸烟情况及 TNM分期均无明显相关性(P＞0.05)，而AQP3在腺癌中的表达阳性率明显高于鳞癌(P＜0.05)，中、高分化组的表达阳性率明显低于低分化组(P＜0.05)，有淋巴结转移组的表达阳性率明显高于无淋巴结转移组(P＜0.05)，见表1。

表1 AQP3在肺癌患者癌组织中的表达与临床病理因素的关系

AQP3在非小细胞肺癌患者血清中的表达水平与患者的性别、年龄、吸烟情况无相关性(P＞0.05)，而在腺癌中表达明显高于鳞癌(P＜0.05)，在低分化组中表达高于中、高分化组(P ＜0.05)，临床分期为III期组的表达高于I、II期(P＜0.05)，有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组(P ＜0.05)，见表2。

表2 AQP3在肺癌患者血清中的表达与临床病理因素的关系

3 讨论

水通道蛋白是一组能介导水的快速跨膜转运的膜通道蛋白，分子量约30kDa，属于固有蛋白家族。该蛋白能增加细胞膜的通透性，参与水的分泌、吸收以及细胞内外平衡的调节。首次被人类认识的水通道蛋白是AQP1，是由Argre等鉴定人类Rh血型抗原时于红细胞膜上偶然发现的。随着研究的不断进展，目前已发现的该家族成员已有13个，即AQP0～12，称为水通道蛋白家族[1，2]。现对于呼吸道中AQPs的分布研究较明确的有 AQP1、3、4、5四种，其中 AQP3主要分布在气管和支气管的假复层上皮细胞基底膜以及部分肺泡Ⅱ型上皮细胞[3]。

恶性肿瘤细胞的快速生长、侵袭和转移除了需要蛋白质、脂类等营养物质外，还需要大量快速跨膜转运的水，近年来研究发现，AQP在肿瘤细胞的生长、血管生成、侵袭和转移中起重要作用[4]。研究表明，水通道蛋白可能参与肿瘤细胞的发生、转移过程[5]。有研究证实，AQP3在肿瘤细胞及肿瘤新生血管内皮细胞中均表达，提示AQP3参与肿瘤的血管生成[6]。推测AQP3表达的改变可能既影响了水分子的运输，又影响了细胞的生命活动。本实验通过两种方法检测了AQP3在肺癌中的表达情况，肺癌患者的癌组织和血清中AQP3的表达水平均显著高于正常对照组，其中，腺癌患者、低分化患者及有淋巴结转移患者肺癌组织中AQP3的表达水平分别高于鳞癌患者、中(高)分化患者及无淋巴结转移患者。这表明在肺癌发生过程中，随着恶性肿瘤细胞的增加，对水分子快速跨膜转运的需求增多，进而AQP3的表达也随之增加，由AQP3形成的水通道可能改变了癌变组织中细胞内的渗透压，转运了大量的小分子物质，加快了肿瘤细胞的快速增殖并向周围基质浸润，提示AQP3在肺癌发生、发展过程中可能起重要作用。另外，血清中AQP3水平上调是肿瘤发生过程的重要事件，也提示血清AQP3可作为肺癌诊断的辅助手段。在肺癌患者中，血清AQP3水平与TNM分期显著相关，而在肺癌组织中AQP3表达水平与TNM分期的相关性无显著的统计学意义，这种差异提示可能血液中AQP3的变化较组织中的变化更为敏感，也可因试验方法不同所致，有待进一步研究证实，研究样本量较少也可能造成这种差异。

综上所述，AQP3可能与非小细胞肺癌的发生、发展密切相关，肺组织中及血清中AQP3表达水平的检测可能作为NSCLC的辅助诊断指标，尤其是血清中AQP3水平的检测具有相对无创、标本易得、可动态观察等优点，值得进一步推广。另外，本实验还提示AQP3抑制剂有待开发。

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