骨髓单个核细胞对大鼠脊髓损伤后行为功能影响的研究

张富运，杨建华，王 蕾，赵中男，热吉普

(佳木斯大学附属第一医院骨一科，黑龙江佳木斯154003)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种以损伤平面以下感觉、运动功能完全丧失为主要症状的中枢神经系统的严重创伤。目前对SCI的治疗仍是难点，随着神经生物学和干细胞技术的迅速发展，骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells，BMMNCs)移植治疗 SCI亦取得了重要进展[1]，但其作用机制仍不清楚。生长因子是脊髓微环境的重要组成部分，其对神经元的存活、神经修复以及轴突生长都具有重要促进或抑制作用，其中，神经营养因子3(neurotrophin－3，NT－3)促进损伤脊髓功能恢复是颇受肯定的[2]。为此，本实验拟建立大鼠脊髓半横断模型，观察BMMNCs在不同时间点对大鼠后肢功能及NT－3表达的影响，进而探讨BMMNCs移植治疗SCI的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级Wistar大鼠(长春市亿斯实验动物技术有限责任公司)120只，雌雄各半，体重180～220g。

1.2 主要试剂

兔抗鼠NT－3多克隆抗体(武汉博士德公司，批号:DB1－07E19B)，即用型SABC－POD(兔IgG)试剂盒(武汉博士德公司，编号:SA1022)，大鼠淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，编号:LTS1083)，灭菌肝素生理盐水。

1.3 骨髓单个核细胞的分离和计数

无菌条件下取大鼠双侧股骨和胫骨，用注射器吸取无菌生理盐水(含肝素钠)冲洗骨髓腔于离心管，用Ficoll密度梯度离心法分离出BMMNCs，光学显微镜下台盼兰计数器计数，检测细胞活性为90%，加无菌PBS液制成BMMNCs悬液，浓度调整为6×1011/L，4℃保存，2h内移植。

1.4 模型制备和动物分组

大鼠麻醉成功后妥善固定，术区常规处理，按肋骨确定T10脊髓，行后正中切口，咬除T9～10棘突及相应椎板，于T10椎骨平面打开椎管，充分暴露脊髓背面及两侧，用外科手术尖刀于脊髓中央动脉向左完全离断，生理盐水冲洗，逐层关闭术区，术后常规消毒，成功制成脊髓半横断模型。术后腹腔注射青霉素防感染，定时排便。120只大鼠，其中6只提取BMMNCs，剩余大鼠造模后2d死亡10只，剩余大鼠随机分为实验组(C组)48只，分别于横断面头尾方向采用局部微量注射法注射15μL BMMNCs悬液;对照组(B组)48只，按C组的方法注射15μL PBS液;假手术组(A组)8只，仅切除对应的椎板并按C组的方法注射15μLPBS液。

1.5 术后动物BBB评分

各组大鼠在术后1、3、5、7、14 和21d 按 BBB 评分标准[3]测试后肢功能。评定前排空膀胱，将大鼠放入一开口大盆(底部为带条纹的地板)，轻敲盆壁，使其爬行，记录动物肢体运动及其协调情况。

1.6 动物组织取材

各组大鼠造模成功1d、3d、5d、7d、14d和 21d取8只行BBB评分后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉;沿肋弓下缘打开腹腔，显露心脏，用麻醉科套管针刺入左心室，拔出针芯快速灌注生理盐水，同时将右心耳剪开放血，灌注至肠系膜血管变白为止;先快后慢灌注含4%多聚甲醛、0.1 M磷酸盐缓冲液共500mL进行固定，迅速于脊髓断面向头尾各1cm处取出完整脊髓，置于4%多聚甲醛固定，4℃冰箱中保存。

1.7 NT－3检测

组织石蜡包埋后制成矢状切片，按免疫组化SABC试剂盒说明书操作。光学显微镜下以胞浆或胞核出现棕褐色或棕色免疫产物为 NT－3阳性表达。用 Leica Application Suite.V3照相系统在 Leica Ver3.4.0显微镜下摄片，Leica Qwin pro.V3.5.1图像分析系统下行细胞平均灰度值测量。每张切片在损伤脊髓区随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×200)，求其灰度值进行数据分析。图像分析系统检测精度最黑为0，最亮为255。免疫阳性产物越多，图像显色越深，灰度值越小，反之，灰度值越大，阳性产物表达越少。

1.8 统计学分析

用SPSS17.0统计软件，对实验数据采用方差分析和t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BBB评分实验结果

见表1，术后各个时间点A组后肢功能评分与B、C组相比较，差异有统计学意义(P＜0.05);B组和C组比较，各个时间点均有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组大鼠BBB评分比较(±s，n=8)

表1 各组大鼠BBB评分比较(±s，n=8)

与A组比较，aP ＜0.05;与B组比较，bP ＜0.05。

组别1d 3d 5d 7d 14d 21d A 组 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 B 组 0.55±0.01a 0.67±0.01a 1.94±0.01a 2.81±0.02a 5.20±0.02a 7.04±0.01a C 组 0.92±0.01a，b 1.39±0.02a，b 3.17±0.01a，b 5.08±0.01a，b 6.90±0.02a，b 9.24±0.06a，b

2.2 各组大鼠受损脊髓组织中NT－3的表达

实验结果见图1～3，表2，图中标尺为100um。显微镜下见A、B、C三组NT－3免疫阳性细胞主要分布于灰质，胞浆着色多见，以大运动神经元为主，也可见染色较弱的毛刷状阳性产物。表2中可见假手术组与实验组、对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05);各时间点实验组平均灰度值与对照组比较明显较低(P＜0.05);实验组平均灰度值于术后1d、3d、5d、7d 逐渐下降，14d、21d 逐渐上升，即 NT －3的表达先增多，7d达高峰，随后减少;对照组平均灰度值于术后1d、3d、5d 逐渐下降，7d、14d、21d 逐渐上升，即 NT －3 的表达亦是先增多，5d达高峰，随后减少;各时间点实验组平均灰度值与对照组比较明显较低(P＜0.05)。

图1 实验组7d脊髓灰质(免疫组织化学ABC法，×200)

图2 对照组7d脊髓灰质(免疫组织化学ABC法，×200)

图3 假手术组脊髓灰质(免疫组织化学ABC法，×200)

表2 各组各时点NT－3平均灰度值比较(±s，n=8)

表2 各组各时点NT－3平均灰度值比较(±s，n=8)

与A组比较，aP ＜0.05;与B组比较，bP ＜0.05。

组别1d 3d 5d 7d 14d 21d A 组 184.59±1.07 182.30±0.33 185.73±0.47 186.11±0.17 189.24±0.19 183.62±0.30 B 组 205.49±1.09a 194.25±0.03a 180.07±1.41a 184.61±0.29a 186.98±0.20a 197.33±0.08a C 组 196.13±0.46a，b 185.27±0.26a，b 174.83±0.72a，b 163.70±0.30a，b 170.12±0.46a，b 179.49±0.62a，b

3 讨论

SCI是神经系统一种严重的疾病，一旦发生，往往意味着患者丧失自理的能力，对患者家庭和社会带来了沉重的负担。SCI难以修复是多因素作用的结果，其中BMMNCs移植治疗SCI近年来受到临床和科研学者的广泛关注。BMMNCs是指骨髓中的细胞核为单个的总称，包括造血干细胞，骨髓间充质干细胞，内皮祖细胞和基质细胞等，是含有多种细胞成分的细胞群。有学者证实[4～6]，BMMNCs可直接分化为血管内皮细胞和平滑肌细胞，形成新的血管;或者以自分泌或旁分泌的方式分泌促血管生长因子从而促进血管新生，骨髓单个核细胞群内众多不同的细胞可能在损伤脊髓的修复中起着重要的作用。和骨髓中某种纯化的细胞相比，BMMNCs可提供细胞之间协助的诱导环境，进而为损伤脊髓修复提供更好的微环境，直接移植可防止体外扩增带来的多元分化潜能和自动迁移性的下降[7]，BMMNCs移植治疗SCI是有效的[8]，但其作用机制尚不十分清楚。

NT－3是一种广泛分布于中枢神经系统的神经营养因子，有学者证明[9]其能阻止受损神经元萎缩，提高神经细胞的存活量，而且与神经系统发育有关[10]。Ding Y等[11]研究发现脊髓损伤后NT－3在受损脊髓灰质的表达量上调，说明受损脊髓对内源性NT－3的需求增加，NT－3表达升高可改善脊髓损伤大鼠后肢功能，这可能与其能够促进脊髓轴突再生有关[12]。

本实验BBB评分、免疫组织化学结果显示大鼠后肢功能与NT－3的调节密切相关。对照组与假手术组相比:术后1d、3d的NT－3表达较少，逐渐增多的，于术后5d达峰，而后逐渐下降接近假手术组，BBB评分显示对照组大鼠后肢功能逐渐改善，提示NT－3的表达增高可能与SCI大鼠后肢功能好转有直接关系，这与Ding Y等的研究是一致的。实验组与对照组相比:NT－3的表达量明显较高，BBB评分也显示大鼠后肢功能较好，提示BMMNCs可改善SCI大鼠的后肢功能且可能与NT－3的表达增高相关。免疫组化和BBB评分检测表明:实验组大鼠后肢功能与受损脊髓组织中NT－3的表达基本呈正相关趋势，提示实验组大鼠后肢功能的改变可能与BMMNCs移植后调节NT－3的表达有关;NT－3可提高神经元的存活，促进轴突再生，而轴突完整性是脊髓功能发挥的重要基础，BMMNCs可能通过提高NT－3的表达促进轴突生长，神经细胞存活，进而改善脊髓功能。

据上所述，BMMNCs对SCI大鼠后肢功能有改善作用，受损脊髓组织中NT－3的表达上调，进而修复损伤脊髓可能是其机制之一。但SCI恢复过程是复杂的，是多因素作用的结果，受损脊髓组织中NT－3的表达上调是否是BMMNCs改善SCI大鼠行为功能的主要机制尚需进一步研究。

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