大鼠脊髓损伤早期Survivivn表达规律与细胞凋亡的关系

孙海中，周成福，马晓茹，梁 宇

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154003;2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯154007)

脊髓损伤(Spinal Cord Injury，SCI)是一种外科创伤中比较常见的损伤，具有较高的致残率和死亡率。据保守统计，欧美发达国家 SCI的发生率为10.4～83/百万[1]，而且随着社会的发展，还有逐年上升趋势，引起了临床医学领域极大关注。脊髓损伤主要分为原发性损伤和继发性损伤，原发性损伤是指创伤发生时致伤暴力直接破坏细胞结构，造成细胞的死亡;原发性损伤后一段时间内可引发周围组织继发性损伤，很多研究证实[2]继发脊髓损伤主要是程序性的神经元细胞的凋亡，是一系列以生化反应为特征的主动自行破坏过程，可持续数小时、数天甚至数月;继发损伤时期具有可逆性而且可被控制[3]，因此，充分了解这种继发性细胞凋亡的分子学基础，就有可能通过有效方式拮抗神经细胞凋亡，提高神经元和神经细胞的存活率从而改善患者生存率和生活质量。而Survivin属于凋亡抑制蛋白(Inhibitior of Apoptosis Protein，IAP)家族新成员，具有独特的分子结构，也是目前发现最强的凋亡抑制因子[4]。本试验通过制作大鼠脊髓损伤模型，观察脊髓损伤早期Survivin的动态表达及细胞凋亡的关系，探讨其在脊髓损伤机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级健康成年Wistar大鼠56只，体重(230±20)g，雌雄各半;由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供[生产全格证SCXK(吉)－2011－0004]。实验大鼠按照随机分组原则，分为假损伤组(对照组，n=8)、损伤组(实验组，n=48);其中损伤组再根据损伤后经历的时间不同随机分成6个亚组(12h、24h、3d、5d、7d、10d)，每组 8 只大鼠。

1.2 主要仪器和试剂

日本奥林巴斯显微镜LSM 510 META、德国莱卡RM2015切片机、日本三洋MIR－153型干燥箱 、日本三洋MDF－382E型低温冰箱、江苏太仓医用仪器厂DSHZ－300型恒温

水浴箱、浙江临安爱迪仪器厂YWY781B型医用微波炉。Survivin兔源多克隆抗体、SP－9000通用试剂盒和DAB显色试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 动物模型制备

用10%水合氯醛(0.35mL/100g)行腹腔麻醉，待大鼠麻醉满意后，俯卧位固定于手术台上，以第10胸椎棘突为中心剪除背部毛发，按无菌手术操作原则;假伤组仅暴露T9～11棘突和椎板，并咬除T10及上下缘部分T9、T11棘突和椎板，显露该节段硬脊膜，然后缝合肌肉、皮下、皮肤层。损伤组显露硬脊膜后用2mm×4mm大小的光滑弧形轻质塑料垫片置于硬脊膜上，根据改良 Allen＇s[3]打击法原理，用重 7.5g 打击锤在光滑玻璃杆引导下自10cm高度自由落下打击在塑料垫片上，同时观察大鼠有尾巴、双下肢及躯体痉挛性抽搐后双下肢瘫痪说明造模成功;然后消毒后缝合各层。术后分笼喂养，自由进食;每8小时一次人工按摩膀胱帮助排尿，直至建立自主排尿功能。

1.4 标本采集与处理

分别于术后 12h、24h、3d、5d、7d、10d 从损伤组中随机选择8只大鼠处死，分别用生理盐水和4%多聚甲醛心脏灌注后，切取脊髓损伤段及损伤上下各约0.5cm脊髓，置于4%多聚甲醛内固定48h后，然后进行常规石蜡包埋，10μm连续矢状面切片，每个标本随机取连续切片多张。分别行HE染色、免疫组化及TUNEL染色标记。

1.5 免疫组化

采用S－P法检测Survivin蛋白的表达，具体的操作严格按照试剂盒说明书步骤进行，一抗的工作浓度为1:50;在光学显微镜下观察Survivin免疫反应的结果，每张切片上随机选择损伤灶及周围6个不连续的高倍视野观察，并记录每张高倍镜下(400×)阳性细胞数。

1.6 TUNEL 标记

采用TUNEL原位标记DNA片段检测细胞凋亡，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，染色阳性结果为细胞核和(或)细胞质染成棕黄色颗粒。在光学显微镜下(×400)观察，并对各组TUNEL染色切片进行凋亡细胞观察计数6个视野，计数凋亡细胞数。

1.7 统计学分析

采用SPSS17.0统计软件包对数据进行处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示。每组均经正态体验和方差齐性检验后，采用独立样本t检验比较两组之间差异;相关性分析采用Pearson相关性分析法。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE 染色

光镜观察见对照组脊髓组织结构清晰，形态规则，白质致密，灰质与白质中可见较多的神经元分布，胞核大多位于细胞中央，核仁清晰可见，大部分胞体轮廓清晰，结构完整(图A)。损伤组12h可见有脊髓组织结构破坏，层次不清，伴有水肿和大量破碎的红细胞，见到大量淋巴细胞浸润;3d组可见到灰质与白质中都可见大量神经细胞形态不完整，并出现大量碎裂的细胞(图B)。随着损伤后时间延长，灰质中与白质中都可见因大量组织与细胞溶解而遗留下的空洞。

2.2 免疫组化

Survivin蛋白阳性细胞的胞浆和(或)细胞核染成棕黄色或深褐色，主要分布在损伤灶及周围神经元及小血管的内皮细胞。对照组可见偶有表达(图C);损伤组12h偶见到Survivin蛋白表达、随后逐渐增多，3d达高峰(图 D)，5d、7d减少，10d仍有一定量的表达;损伤组与对照组比较均有统计学意义(P＜0.05)见表1。

2.3 TUNEL标记及计数结果

凋亡细胞呈棕褐色和(或)棕黄色，染色质浓缩成深染颗粒，细胞核固缩、边聚，形状不规则，形成固缩的凋亡小体;凋亡小体主要分布于损伤脊髓及其周围组织区域。对照组可见少量散在分布的凋亡细胞，损伤组则见较多凋亡细胞呈弥散性分布;损伤组12h出现较多阳性细胞;24h灰质和白质中阳性细胞数量增多，3d达到高峰，7d、10d呈阳性染色的凋亡细胞逐渐减少仍有表达，主要位于周围组织的白质中。

2.4 脊髓损伤后Survivin蛋白的表达和细胞凋亡的相关性

经过统计分析，大鼠脊髓损伤早期Survivin蛋白的表达水平和细胞的凋亡成正相关(r2=0.6468，P＜0.01);即脊髓损伤早期随着凋亡细胞的增多，Survivin蛋白的表达水平也成上升趋势(见图1)。

图1 Survivin蛋白表达数与细胞凋亡数相关性分析

图A 假损伤组，细胞结构完整，体轮廓清晰(HE×200)

图B 损伤组3d，组织结构疏松，细胞胞排列紊乱，并有大量淋巴细胞浸润(HE×200)

图C 假损伤组，未见到Survivin蛋白明显表达(免疫组化×400)

图D 损伤组3d，Survivin蛋白表达达高峰，阳性细胞核和/或浆染成棕黄色(免疫组化×400)

表1 各组大鼠损伤脊髓细胞凋亡数(±s，个/视野)及Survivin蛋白表达(平均阳性细胞数n=8)

表1 各组大鼠损伤脊髓细胞凋亡数(±s，个/视野)及Survivin蛋白表达(平均阳性细胞数n=8)

损伤组与假损伤组比较*P＜0.05;△P＜0.01;▲P＞0.05。

分组 凋亡数 Survivin 表达假损伤组1.5±1.19 0.43±0.41损伤组伤后12h组 37±6.65▲ 6.56±3.95*伤后1d组 44±5.78* 13.62±1.32*伤后3d组 89±7.52* 20.44±1.89△伤后5d组 29±3.68* 12±1.36*伤后7d组 19±4.37* 12.25±2.09△伤后10d组 12±3.16* 9.88±1.19*

3 讨论

脊髓损伤(SCI)是一种比较常见的损伤性疾病，具有较高的致残率和昂贵的治疗费用特点，给患者和家庭带来严重的精神和生活的负担，因而脊髓损伤的临床有效治疗也是迫切需要解决的难题。研究表明[5]，脊髓损伤后的病理损害过程分为原发性损伤和继发性损伤，原发性损伤是由受伤后立即发生的机械压迫、挫伤导致的;继发性损伤是原发性损伤后由分子和细胞介导的复杂的病理过程[6]，细胞凋亡是参与继发性损伤的主要形式[7～9];因此，充分了解这种细胞死亡的分子学基础，就有可能通过某种有效方式拮抗神经细胞凋亡，提高神经元和神经细胞的存活率，从而达到减轻脊髓损伤的目的。而Survivin是由Mega等[4]在1997年首次分离出来的基因，又名存活素或生存素，属于凋亡抑制蛋白(Inhibitior of Apoptosis Protein，IAP)家族的新成员，具有独特的分子结构，并且也是目前发现的最强的凋亡抑制因子。根据文献报道[10]，Survivin在胚胎形成过程中和肿瘤组织中有表达，但在大多数正常和分化成熟的组织中无表达，其作用主要为抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂。Jiang等[11]的研究显示，Survivin能够抑制中枢神经系统神经元的凋亡;但是目前，Survivin在肿瘤中研究广泛，但在脊髓损伤研究中国内外文献中鲜有报道。

本研究显示Survivin的表达随时间的变化呈现一定的特点:假损伤组偶有表达;损伤组12h可见到少量表达、Survivin蛋白表达逐渐增多，3d达高峰，7d开始下降、10d仍有表达;其阳性细胞主要位于损伤灶及周边区的神经细胞。通过分析发现Survivin表达与细胞凋亡存在正相关性。本试验通过对Survivin的动态表达变化与脊髓损伤细胞凋亡规律分析结果，提示在脊髓损伤的早期存在神经细胞凋亡，而且3d时凋亡达高峰;Survivin的表达在脊髓损伤后也升高，也在3d时出现高峰，而后下降;而且两者之间存在正相关。这表明脊髓损伤后Survivin的表达升高可能抑制了神经细胞的凋亡，提高神经元和神经细胞的存活率。因此，选择性增强Survivin的表达有可能抑制脊髓继发性损伤，从而起到保护脊髓神经细胞的作用，为临床治疗脊髓损伤提供了一种新的思路。

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