丹参川穹嗪注射液治疗胶原诱导性关节炎大鼠的实验研究

王建峰

(攀钢集团总医院，四川攀枝花617023)

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种原因未明的，以对称性地累及外周关节与持续性滑膜炎症为主要表现的慢病程、多系统性免疫病。多数患者可以发展为病程迁延的多关节炎，伴有关节功能障碍，甚至出现关节外的系统性表现。微小血管的损害和滑膜细胞量增多被认为是类风湿关节炎滑膜炎的早期病理变化。病情发展后，滑膜水肿，绒毛形成。晚期，生成一些免疫球蛋白的多克隆自身抗体。这其中亦包含了各种趋化因子，受体及介质的相互影响及作用。丹参川芎嗪注射液是由丹参与盐酸川芎组成的复方制剂。本复方制剂有扩张外周血管阻力，减低TXA2的水平，直接清除氧自由基，改善循环，减轻心脏负荷，降低血液黏滞度，改善微循环的作用。亦有减少内皮素的分泌，抑制免疫反应和免疫复合物的形成的作用。此次研究是应用丹参川穹嗪来治疗胶原诱导性关节炎大鼠，观察记录其疗效，并测定其血清中IL－1β、IL－6、TGF－β表达水平。观测丹参川穹嗪在胶原诱导性大鼠中的治疗效果，为丹参川穹嗪在临床的应用提供一定的方向线索。

1 资料与方法

1.1 一般资料

60只清洁级Wistar大鼠，雌性，体重165～200g。卡介苗冻干粉(北京生物制品研究所)，牛Ⅱ型胶原(美国Sigma公司)，丹参川穹嗪注射液(吉林四长制药有限公司)，IL－1β、IL－6及TGF－β酶联免疫ELISA试剂盒(天津索罗门生物科技有限公司)。

1.2 方法

将牛Ⅱ型胶原蛋白与卡介苗及等体积量CFA充分乳化后，在随机选取的45只大鼠背部与尾部皮下多点注射该乳化剂0.2mL，复制胶原诱导性关节炎大鼠(collagen－induced arthritis，CIA)模型，为了保证成功，于第7、14再次给予加强注射乳化剂，剩余的15只作为对照组，给予同等剂量的生理盐水注射。将造模成功的45只大鼠随机分为3组，分别是胶原性关节炎模型组、丹参川穹嗪治疗组与地塞米松治疗组。然后，在造模后第15天选取15只通过腹腔注射丹参川穹嗪，按20mg/kg的剂量给药，连续给药两周，此为丹参川穹嗪组。再次选取15只使用地塞米松磷酸钠注射液，按0.2mg/kg剂量腹腔注射给予，同理连续给药2周。剩余15只模型组与15只对照组给予等量的生理盐水处理。实验完毕后所有大鼠断头处死，每只取血约5mL，离心机4000r/min，低温离心10min，取上清液，最后保存于－20℃冰箱中待测。

1.3 统计学处理

采用统计学软件包SPSS17.0，数据值采用均数±标准差(±s)来表示，两组的比较采用t检验，以P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

模型大鼠血清中IL－1β、IL－6表达水平相较正常对照组有明显升高(P＜0.05);治疗组中丹参川穹嗪组较造模组有显著降低(P＜0.05);其与地塞米松组无明显差异，无统计学意义(P＞0.05)。

同样的，模型组大鼠血清中TGF－β的水平较正常组是显著下降(P＜0.05);治疗组中丹参川穹嗪组比造模组有明显升高(P＜0.05);其与地塞米松组无显著差异(P ＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清IL－1β、IL－6及TGF－β水平比较(±s，n=15)

表1 各组大鼠血清IL－1β、IL－6及TGF－β水平比较(±s，n=15)

注:*与对照组比较，P＜0.05，#与造模组比较，P＜0.05。

组别 TGF－β IL－1βIL－6正常对照组0.91±0.07 13.78±1.52 22.49±1.77模型组 0.40±0.08* 46.39±3.31* 38.13±7.97*丹参川穹嗪组 0.63±0.11*# 27.42±5.63*# 29.23±6.22#地塞米松组 0.68±0.15*# 23.27±4.96*# 25.29±8.66#

3 讨论

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是表现为滑膜关节的慢性渗出性炎症、增生为主要，进而侵蚀关节软骨、骨膜、肌腱与韧带等结缔组织，终末期引起关节破坏畸形、关节功能的完全丧失的自身免疫性风湿性疾病。发病年龄多来自于中老年女性，患病率大约为0.32%～0.36%。随着医学基础学和生物学技术的飞快发展，对于RA的病因、病理机制研究有了一些新的认识和进步。目前大多认为本病是源于多种抗原生物因子介导和参与的免疫紊乱性疾病，可能和遗传、各种感染、环境生态的污染破坏、药物激素水平以及精神心理状态等因素存在密切关系。长久以来，病毒感染因素一直被怀疑为引起RA的主要因素。随着时间的推移，新的观点不断提出，有研究发现类风湿关节炎患者的的免疫细胞的数量与功能方面都出现了较显著地失衡表现。RA的发病患者中Th1/Th2细胞发生失衡，Th1及Th1因子占有明显优势，处在Th1型状态中，通过分泌的大量细胞因子如IL－1β、TNF－α、IL－6、IFN －γ 等加重了炎症反应和损伤;另外在RA患者血清和关节液中观察到TGF－β增高，TGF－β对T细胞活化和增殖、B细胞分化具有特异的抑制作用。丹参川穹嗪注射液作为一种祖国医学中医药方面的复方制剂，其方是通过科学合理的方法把盐酸川穹嗪加丹参素配比提取的注射液。川穹嗪有活血化瘀的作用，其有效成分四甲基吡嗪盐酸盐可以保护血管内皮，具有调节免疫、收缩血管、平衡纤溶和凝血机制，抗血小板活性聚集等作用。丹参素有抑制黏附分子，改善微循环，抑制NO产生等功能。

转化生长因子β(Transforming growth factor－β，TGF－β)该家族中众多蛋白成员都被证明在许多疾病的生理、病理机制中承担了重要的功能。在免疫系统的整体调节上，TGF－β发挥了很重要的作用。近来对动物的免疫实验研究表明，TGF－β直接或间接地的调控了所有参与免疫系统的关联细胞，几乎所有白细胞的增殖、分化一系列生理和病理活动。TGF－β为炎症免疫反应的负方向调控因子，在血浆中生成后侵入几乎所有组织器官，但主要浸润到关节滑膜内，并和基质结合到一起，来进一步发挥免疫抑制效应。IL－l主要是由多种细胞产生，比如:星状细胞、成纤维细胞、树突状细胞及T、B细胞等。此外几乎所有的有核细胞，均可产生IL－1。IL－1的家族至少有3个成员，即2个炎症性激动剂IL－1α、IL－1β与l个抑制前两者的受体性拮抗剂IL－1Ra。在人类IL－1β是起主要作用的，IL－1β主要由细胞释放出来，它能分泌到细胞膜的外面，主要是通过作用于其它细胞而发挥其生物学效应。IL－1诱导的生物学效应的机制有:(1)对基因表达的影响有，IL－1对不同的基因表达行使其起始转录或稳定mRNA的功能，是IL－1具有不同生物学特性的基础。(2)对受体表达的影响有，IL－1可以与靶细胞上的特异性受体结合后，才能充分发挥其生物学效应，经过细胞内部的信息传递，来抑制一些基因的表达。(3)协同作用有，IL－1与缓激肽等其它细胞因子以及生长因子都有协同作用。IL－6亦有广泛的生物学活性，尤其是在机体免疫反应中具有重要的作用。IL－6可以具有强有力的诱导多克隆性B细胞分泌Ig M、Ig G与Ig A，也是T细胞产生细胞因子受体的化学诱导剂。L－6由于对T淋巴细胞兼有有趋化和活化两方面的作用，因而在关节液中，IL－6可能促进 T细胞向炎症性关节腔聚集并促使其活化。IL－6还可以对中性粒细胞与单核巨噬细胞的活性具有调控作用，并能刺激TNF－α、IL－1β、IL－15、IL－8、MCP－1和 IL－17等细胞因子的生成，大大加强了血管内皮与白细胞之间的黏附作用，这些都有助于淋巴细胞聚集于炎症局部周围，扩大炎症反应过程。L－6还能促使B淋巴细胞增殖，促进 NK细胞分泌细胞因子与增加粘附分子的分布的转变，最终影响T淋巴细胞对组织的浸润、迁移。

本研究胶原性关节炎大鼠血清IL－1β、IL－6表达水平在造模组中有明显升高，揭示二者在大鼠关节炎形成中扮演积极重要的角色，而TGF－β在模型组表现为降低，表明其有限制淋巴细胞因子活性，阻碍细胞因子的产生作用。治疗两周后，血清中IL－1β、IL－6水平有明显下降，相应的TGF－β因子水平显著升高。这些都说明丹参川穹嗪注射液明显的调节免疫平衡，抑制炎症产生的作用。也表明了其对胶原诱导性关节炎模型大鼠有明显的积极治疗作用，也为此复方制剂在临床中的合理运用提供一定的参考价值意义。另外，其具体的机制作用，尚不能完全明了。有待进一步深入研究。

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