鸡传染性鼻炎灭活疫苗生产检验用副鸡禽杆菌Hpg－8株的保存期试验

彭小兵，蒋玉文，李旭妮，彭国瑞，王秀丽

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

鸡传染性鼻炎是由副鸡嗜血杆菌引起的一种细菌性传染病，表现为眼眶下水肿、打喷嚏、产蛋减少［1］，世界各地养禽业均采用疫苗进行免疫接种来控制该病的发生。2005年，Blackall等［2］根据 16S rRNA碱基序列的同源性及生化特性方面的相似性，将副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)归入巴氏杆菌科的一个新属，即禽杆菌属(Avibacterium)，副鸡嗜血杆菌也因之更名为副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)。副鸡禽杆菌Hpg－8株(A型)是制备鸡传染性鼻炎灭活疫苗、鸡传染性鼻炎(A+C型)、新城疫二联灭活疫苗的生产检验用菌种，《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二○○○版)［3］规定，该菌种在－40℃的保存期为4年。本研究对不同冻干年代的副鸡禽杆菌Hpg－8株菌种分别进行了对SPF鸡的毒力测定和免疫原性试验，为该菌种制定更加合理的保存期提供了参考。

1 材料与方法

1．1 材料 副鸡禽杆菌(原名副鸡嗜血杆菌)Hpg－8株(CVCC254)，由本实验室分别于1991年6月19日、1997年10月22日、2001年7月14日、2011年4月14日繁殖冻干，检定合格后交菌种保藏室－70℃保存。鸡肉汤培养基由本实验室制备，半合成培养基由北京中海生物科技有限公司提供，鸡血清由北京元亨金马生物科技有限公司提供。2月龄SPF母鸡、5日龄鸡胚均由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供。

1．2 方法

1．2．1 菌种对SPF鸡的毒力测定 每批冻干菌种无菌操作打开，用鸡肉汤培养基溶解后卵黄囊接种5日龄鸡胚，待鸡胚死亡后收取卵黄液，置－20℃保存。取卵黄液按《中华人民共和国兽药典》(二○一○年版三部)［4］进行活菌计数，根据计数结果将卵黄液用鸡肉汤培养基稀释成不同的滴度，每滴度各眶下窦注射2月龄SPF鸡5羽，每日观察记录鸡的发病情况，观察7 d。面部出现一侧或两侧眶下窦及周围肿胀或流鼻涕或兼有流泪者，判为发病。

1．2．2 菌种的免疫原性检定

1．2．2．1 制苗 按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二○○○版)的方法制备油乳剂灭活疫苗，配苗前的菌体悬液浓度为56亿/mL。置2～8℃冰箱保存备用。

1．2．2．2 免疫 取制备好的疫苗恢复至常温，每批各颈部皮下注射60日龄SPF鸡8羽，每羽注射0．5 mL;同时设空白对照鸡4羽，每羽注射PBS溶液0．5 mL，与免疫组同条件饲养。

1．2．2．3 攻毒 免疫30 d后，取副鸡禽杆菌Hpg－8菌株培养物，用鸡肉汤培养基进行30倍稀释后，对所有鸡眶下窦注射0．2 mL(50～100万CFU)，观察14 d。

2 结果

2．1 菌种对SPF鸡的毒力测定结果 结果如表1所示。结果表明，各冻干年代的菌种在约3万CFU/羽的剂量时，仍能使SPF鸡5/5发病，均达到甚至超过了《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二○○○版)的标准(10万CFU/羽剂量使鸡5/5发病)。

表1 不同冻干年代副鸡禽杆菌Hpg-8株对SPF鸡的毒力试验结果

2．2 菌种的免疫原性检定结果 如表2所示。结果表明，1991、1997、2011年冻干的菌种在制苗后免疫SPF鸡，分别能使鸡8/8、7/7、7/7免受副鸡禽杆菌强毒的攻击，达到了《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二○○○版)的标准(对照组4/4发病时，免疫组至少6/8保护或对照组3/4发病时，免疫组至少7/8保护)。

表2 不同冻干年代副鸡禽杆菌Hpg-8株的免疫原性试验结果

3 讨论

作为疫苗生产检验用菌种，保持良好的毒力和免疫原性是生产合格疫苗和开展检验工作的前提和关键，因此对冻干菌种在一定保存期内的毒力和免疫原性是否仍保持原有标准进行探索具有重要意义。然而，迄今为止尚未有关于副鸡禽杆菌保存期试验的相关报道。该菌培养物以非冻干的形式直接在2～8℃或－20℃保存，其自然死亡率均很高。《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二○○○版)亦规定，副鸡禽杆菌Hpg－8株菌种在－40℃的保存期也仅为4年。在从事鸡传染性鼻炎类灭活疫苗进口产品的质量监督检验过程中注意到，来自3个不同国家的企业提供的副鸡禽杆菌菌种在－20℃的保存期分别为10、13、20年，且菌种经本实验室复苏后其生长特性及毒力均良好。菌种的复苏、复壮、繁殖、冻干和检定工作不仅需要投入较长的时间，同时尚需消耗一定数量的人力、财力和物力。因此，采用科学有效的保存方法并制定合理的保存期，既能有效地延续菌种的固有特性，又可避免不必要的资源浪费，并可提高工作效率。本试验的结果表明，真空冻干菌种于－70℃保存10、14、20年，其毒力仍能满足要求;真空冻干菌种于－70℃保存14、20年，其免疫原性仍能满足要求。因此，制定更长副鸡禽杆菌Hpg－8株菌种的保存期显然是必要的，并且是可行的。

副鸡禽杆菌Hpg－8株菌种在各年代繁殖冻干时均按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二○○○版)的标准检定了全部项目，本次试验对不同保存年代菌株的毒力和免疫原性重新进行了试验，结果均符合规定，表明该菌株于－70℃保存20年，仍可作为鼻炎类疫苗制品的生产检验用菌种。

［1］ 陆承平．兽医微生物学［M］．北京:中国农业出版社，2007:144－147．

［2］ BlackallPJ，ChristensenH，BeekenhamT，etal．Reclassification ofPasteurella gallinarum，［Haemophilus］ paragallinarum，Pasteurellaavium andPasteurellavolantium asAvibacterium gallinarumgen．nov．，comb．nov．，Avibacteriumparagallinarum comb．nov．，Avibacteriumaviumcomb．nov．andAvibacterium volantiumcomb．nov［J］．IntJSystEvolMicrobiol，2005，55(Pt1):353－362．

［3］ 农业部兽用生物制品规程委员会．中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○版［S］．

［4］ 中国兽药典委员会．中华人民共和国兽药典三部二○一○版［S］．