脂蛋白相关磷脂酶A2酶活性水平及其I198T基因多态性与2型糖尿病的相关性研究

岳志红，贾 玫，李珊珊

（北京大学人民医院 检验科，北京100044）

2型糖尿病在中国是一项重大的公共卫生问题，最近报道在我国糖尿病的发病率已经增加到9．7%，已经远远超过了预计2025年中国糖尿病发病率将增加到8%［1］的推论。糖尿病慢性血管并发症是患者死亡及致残的首要原因，糖尿病加速动脉粥样硬化发生发展是引起血管并发症的重要机制。脂蛋白相关磷脂酶 A2（lipoprotein－associated phospholipase A2，Lp－PLA2）是新近发展的炎症反应因子，是动脉粥样硬化发生的独立危险因子［2－4］，在动脉粥样硬化的发生发展的各个阶段发挥着重要作用［5］。但是，目前，对Lp－PLA2酶活性及其基因多态性与2型糖尿病发生发展的关系研究甚少。因此，本实验收集了117例2型糖尿病患者和203例健康对照者，探讨Lp－PLA2的酶活性水平及其I198T点突变与2型糖尿病患者动脉粥样硬化发生的遗传机制。

1 对象与方法

1．1 对象

1．1．1 2型糖尿病组：收集2009年10月至2010年5月，北京大学人民医院糖尿病住院患者117例，均符合1999年世界卫生组织（WHO）诊断标准，且排除：（1）1型糖尿病、继发性糖尿病及近期发生过糖尿病并发症患者；（2）严重肝、肾功能不全患者；（3）心力衰竭及风湿瓣膜性心脏病患者；（4）感染性疾病及肿瘤患者；（5）免疫性及血液性疾病患者。根据是否服用降脂药分为两组：T2DM1为服用降脂药组；T2DM2为未服用降脂药组。

1．2．2 健康对照组：收集2011年3月至2011年5月，北京某单位职工体检者203名，均无2型糖尿病病史，且均无内科系统器质性病变。

1．2 方法

1．2．1 血液生化指标的测定 超敏C反应蛋白（High sensitivity C－reactive protein，Hs－CRP）、脂蛋白a（lipoprotein a，Lp（a））、胆固醇（Cholesterol，CHO）、甘油三酯 （Triglyceride，TG）、空腹血糖（Glucose，GLU）、高密度脂蛋白胆固醇（High－density lipoprotein cholesterol，HDL）、低密度脂蛋白胆固醇（Low－density lipoprotein cholesterol，LDL）测定使用日立7600全自动生化分析仪；试剂、校准品及质控品均由日本和光公司提供。

1．2．2 血清Lp－PLA2活性水平的检测 采用美国Cayman公司提供的PAF－AH活性测定试剂盒，使用BioTek Elx808全自动酶标仪，测定血浆中Lp－PLA2活性水平。

1．2．3 人全血标本基因组DNA的提取 采用日本东洋纺（TOYOBO）磁珠法（编号 NPK－101）DNA提取试剂盒，用乙二胺四乙酸二钾抗凝新鲜全血标本，严格按试剂盒要求进行操作，提取基因组DNA标本－80℃保存备用。

1．2．4 引物及TaqMan探针设计 引物设计采用Primer 5．0软件，由北京天一辉远生物技术有限公司合成，北京赛百盛生物技术公司合成TaqMan探针（5’– TGCAGCAGATTGGTCCTTGAAATAGTA－3’）。I198T点突变扩增片段长度164bp，野生和突变上游引物3’端－2位引入错配碱基“G”（正配碱基应为“T”）（野生引物5’– GAGCCAAGACTTGTCCCCGA－3’；突 变 引 物 5’－GAGCCAAGACTTGTCCCCGG－3’）。TaqMan探针与上游引物扩增的模板链互补。TaqMan探针5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭基团TAMRA。

1．2．5 TaqMan－ARMS方法反应体系及测定条件：使用BIO－RAD Opticon 2荧光定量PCR仪检测TaqMan探针FAM荧光信号。反应体系：人基因组 DNA（2．8μg／ml）2μl，2．5×realMasterMix，8 μl，上、下游引物各0．25μmol／L，探针0．25μmol／L，20×Probe Enhancer solution 1μl，ddH2O 6μl。反应条件94℃2min，94℃20sec，56℃35sec，45个循环。

1．2．6 基因型判断标准 野生型为Δct＞7．13±0．55或 M引物无扩增曲线；杂合突变型为－0．21＜Δct＜0．71－7．98；纯合突变型为 Δct＜－7．98±3．97或W引物无扩增曲线。当W、M引物均有扩增曲线，且Δct值在－4．01＜Δct＜－0．21或0．71＜Δct＜6．58范围时复查或测序。随机抽取40份标本进行测序，与TaqMan－ARMS检测I198T点突变的结果一致，符合率为100%（注：M引物：突变引物；W引物：野生引物）。

1．3 统计学分析

采用HWE软件分析两组的Hardy－Weinberg平衡；采用SPSS16．0软件，符合正态分布的计量资料用¯x±s表示，不符合正态分布者选用中位数（25%，75%）表示，并转化为以10为底的对数值进行统计分析。应用独立样本t检验对2型糖尿病组和健康对照组的基本特征与Lp－PLA2的酶活性水平进行分析；应用方差分析对不同基因型的酶活性水平进行分析；应用卡方检验对基因频率进行分析：应用logistic回归分析对Lp－PLA2的酶活性水平与2型糖尿病相关性进行分析。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 研究对象的基本特征

由表1可见，T2DM2组、T2DM1组和对照组的平均年龄分别是（69．70±9．48）（67．94±10．87）岁和（68．77±11．65）岁，无统计学意义。T2DM2组和T2DM1组糖尿病患者均进行严格血糖控制，GLU间差异并无统计学意义。T2DM2组和T2DM1组HDL－C较对照组低，组间差异均有统计学意义（P＜0．001）。Hs－CRP、Lp（a）高于对照组，组间差异均有统计学意义（P＜0．005）。但是，TG在3组组间差异无统计学意义（P＞0．05），但T2DM2组和T2DM1组CHO和LDL－C较对照组低，组间差异均有统计学意义（P＜0．001）。糖尿病患者为了防止并发症，采取严格降脂治疗。而健康对照组为老年人，且未服用降脂药，故T2DM组的CHO及LDL值会低于健康对照组。?

表1 研究对象的基本特征（¯x±s）

2．2 Lp－PLA2的酶活性水平与2型糖尿病的相关性

随机选择部分标本测量Lp－PLA2的酶活性水平。Lp－PLA2的酶活性水平在T2DM2（未服用降脂药n＝39）、T2DM1（服用降脂药n＝26）和Control（n＝116）组成依次递减趋势［29．44（16．10，55．81），21．39（12．42，52．82），19．77（14．63，26．61）nmol·ml－1·min－1］，且组间差异有统计学意义，图1。

进一步按照Lp－PLA2的酶活性水平根据3个四分位数将研究对象分为不同水平组Q1－Q4，评估具有不同Lp－PLA2酶活性水平2型糖尿病的患病风险。表2给出了较高的三个组与最低组相比2型糖尿病OR值及95%CI。校正年龄和性别后，与最低组（Lp－PLA2＜14．79nmol·ml－1·min－1）相比，最高组（Lp－PLA2＞34．17nmol·ml－1·min－1）2型糖尿病的 OR是5．05（95%CI，1．88～13．60）（模型1）。进一步校正传统冠心病危险因素包括CHO、TG、Hs－CRP、Lp（a）后，关联更加显著（OR ＝12．21，95%CI，2．88～51．80）（模型2）。在模型2基础上进一步校正LDL和HDL（模型3），关联依然显著（OR ＝9．49，95%CI，2．02～44．63）。

图1 Lp－PLA2的T2DM与健康对照组的酶活性水平

表2 Lp－PLA2酶活性水平与2型糖尿病的相关性

2．3 基因多态性

2．3．1 I198T基因型及等位基因频率比较 2型糖尿病组和健康对照组所有多态符合Hardy－Weinberg平衡。I198T点突变有3种基因型II型、IT型、TT型（表3）。与健康对照组比较，2型糖尿病组的II基因型频率与健康对照组无显著差异（P＞0．05），IT基因型频率高于健康对照组（P＜0．05），TT基因型频率低于健康对照组（P＜0．05）；组间等位基因频率比较，差异无统计学意义。

表3 T2DM组和对照组I198T基因型及等位基因频率比较（%）

2．3．2 基因型分组Lp－PLA2酶活性水平的比较由表4可知，与基因型IT相比，基因型II的Lp－PLA2酶活性最高［22．79（15．49，36．11）nmol·ml－1·min－1，P＜0．05］。基因型 TT 的 Lp－PLA2酶活性最低［15．70（8．83，22．60）nmol·ml－1·min－1，P＜0．05］（图2）。

表4 I198T点突变不同基因型的Lp－PLA2酶活性水平

2．3．3 I198T基因型与2型糖尿病相关性 见表5，以T2DM（是，否）为因变量，基因型（II，或IT和TT）为自变量，Binary logistic回归分析显示，与基因型II相比，基因型TT与2型糖尿病的关联不显著（P＞0．05），基因型IT与2型糖尿病的关联显著（OR：2．13CI：（1．11－4．07）P＜0．05）。

表5 I198T点突变不同基因型的发生2型糖尿病的危险性及其95%可信区间

图2 Lp－PLA2在I198T不同基因型的酶活性水平

3 讨论

3．1 Lp－PLA2酶活性水平与2型糖尿病相关性

Lp－PLA2又称为血小板活化因子乙酰水解酶（PAF－AH），是由441个氨基酸残基组成的一种丝氨酸酯酶，属于磷脂酶家族，分子量50kDa。人血清中Lp－PLA2主要由成熟的巨噬细胞和淋巴细胞分泌，并受炎性介质的调节，而血小板活化因子（PAF）促进其分泌。在血浆中，约85%Lp－PLA2与LDL结合，尤其是与小而密的负电性LDL结合，其余与HDL或极低密度脂蛋白（VLDL）结合［6］。最近，国外几个较大的流行病学和临床前瞻性研究认为，血清Lp－PLA2是心血管事件的独立危险因素，参与炎症反应，与动脉粥样硬化关系密切。

本研究发现Lp－PLA2的酶活性水平在2型糖尿病患者中显著升高，logistic回归在校正了各项混杂因素包括年龄、性别、CHO、TG，、Hs－CRP、Lp（a）后，Lp－PLA2酶活性的最高组与最低组相比，2型糖尿病的OR值为12．21（2．88－51．80）。以上结果表明，2型糖尿病病人具有较高的Lp－PLA2酶活性，Lp－PLA2可作为糖尿病独立危险因素之一，严重影响临床最终事件的发生。这与来自美国的一项研究结果一致［7］。另一项研究结果也证实，Lp－PLA2的浓度与2型糖尿病并不相关，但是其酶活性水平在2型糖尿病患者中却显著升高［8］。

国内研究表明［9］，罗格列酮能明显减轻糖尿病大鼠血管病变程度，降低血管局部及外周血Lp－PLA2表达。最新国外研究表明［10］，2型糖尿病患者通过强化血糖控制治疗，能够起到抗动脉粥样硬化作用，包括小颗粒LDL减少，结合于HDL的Lp－PLA2的比例增多。这些研究均提示Lp－PLA2水平有可能作为2型糖尿病的治疗目标。本研究还发现，服用降脂药的T2DM1比未服用降脂药的T2DM2的Lp－PLA2的酶活性明显降低。但是，降脂机制需要进一步的研究。

3．2 I198T点突变与2型糖尿病的相关性

本研究表明T2DM组中基因型TT的基因频率显著低于健康对照组，并且其Lp－PLA2酶活性水平最低；基因型IT与2型糖尿病的关联显著。目前，对于1198T多态性与2型糖尿病的研究甚少。一项来自美国杜克大学的研究表明，无论是在家系研究中，还是在病例对照研究中，I198T基因多态性与冠心病的关联不明显［11］。但是，另一项来自德国的研究表明，1198T多态性与冠心病关联显著，杂合子IT患冠心病的风险要显著低于基因II［12］。

综上所述，Lp－PLA2可能成为早期预测2型糖尿病的指标，并在早期发挥作用。但是，Lp－PLA2酶活性水平及其基因多态性在2型糖尿病过程中的确切作用机制尚有待于更深入的研究，明确他们之间的关系，筛查高危人群，将为2型糖尿病疾病的早期诊断和防治提供新的线索。因此，我们需要在不同种族、不同区域、不同性别的人群中进行重复验证，进一步研究Lp－PLA2在2型糖尿病中的发病机制。

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