慢性脑缺血致认知功能障碍大鼠皮层Smac、NAIP表达的变化

王立波，包晓群，刘晓阳＊，于 爽

（1．吉林大学中日联谊医院 神经内科，吉林 长春130033；2．锦州市中心医院）

慢性脑缺血即长期慢性脑低灌注是临床上常见的脑损伤之一，是血管性痴呆（Vascular dementia，VD）、阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）、和皮层下动脉硬化性脑病（Binswanger）病等多种认知障碍性疾病的共同病理过程，其损伤机制尚不完全清楚。近年研究发现Smac、NAIP在细胞凋亡中起重要作用，可参与急性脑缺血神经元凋亡的调控过程，但其是否参与慢性脑缺血致认知功能障碍的损伤尚不清楚。本研究在成功制备慢性脑缺血致认知功能障碍模型基础上，从蛋白和基因水平，探讨慢性缺血大鼠脑内细胞凋亡调控因子Smac、NAIP表达的变化以及丁苯酞对两者的影响。

1 材料与方法

1．1 实验动物与分组

健康雄性 Wistar大鼠150只，体重280－320克，由吉林大学实验动物中心提供。将选取的大鼠通过Morris水迷宫定位航行试验进行筛选。随机分为：假手术组、2VO＋盐水对照组，和2VO＋丁苯酞干预组，每组再根据缺血时间随机分为1、2、3个月组，每组分配大鼠10只。

1．2 模型制备及给药方法

慢性脑缺血大鼠模型采用2VO方法制备。丁苯酞干预组于2VO术后48h内，9mg／kg体重，每日1次腹腔注射给药，共20天；盐水对照组于相同时间分别给与等剂量0．9%氯化钠注射液腹腔注射。

1．3 普通病理及TUNEL方法

模型建立后，从各组大鼠中随机选取6只，以10%（300mg／kg）腹腔注射麻醉，暴露心脏，以12号穿刺针刺入左心室，剪开右心房，首先灌注冷0．9%生理盐水约200ml，待从右心房流出液体清亮时，换用4%多聚甲醛的0．1MPBS（pH7．4）缓冲液200ml灌注固定，断头取脑。取以视交叉为中心相当于前联合连续脑片继续固定4－6h，制片，行HE染色及免疫组化染色。

1．4 RT－PCR 检测脑组织 Smac、NAIP 的 mRNA表达

1．4．1 引物设计 PCR反应引物由上海生工生物技术有限公司合成。扩增产物和DL2000Marker一起用10g·L－1琼脂糖凝胶电泳分离，图像采用上海天能科技有限公司GIS凝胶成像系统照相，特异性条带的丰度值用GIS图像分析系统处理。各引物序列、片段长度和扩增条件如下：

1．4．2 脑组织 mRNA的提取及浓度的测定 取液氮中冻存的脑组织称重，按比例加入Trizol试剂，组织匀浆后室温孵育5min，使其充分裂解，离心，吸取上层水相，至另一离心管中，加入异丙醇，室温孵育10min；4℃，12 000g，离心10min，弃上清，RNA沉于管底；加入75%乙醇，漩涡混匀，悬浮沉淀；4℃，7500g离心5min，尽量弃尽上清；室温晾干或真空干燥5min；DEPC水溶解RNA，紫外分光光度计下测OD260及OD280。留取比值在1．8～2．0的样本进行逆转录。

1．5 统计学处理

本实验数据均采用均数±标准差（¯x±s）表示，目的蛋白和PCR产物电泳条带密度值以灰度×面积／参照物的比值表示。采用SPSS11．0统计软件包处理，多组间比较用方差分析，两两比较采用t检验，以P＜0．05作为统计学显著性差异的判断标准。

2 结果

2．1 慢性脑供血大鼠脑内凋亡检测（TUNEL）

实验结果显示假手术组神经细胞数量、形态分布正常，大鼠额叶皮层神经细胞排列紧密有序，细胞核染色浅，细胞核圆而大，核仁清晰，可见到少数TUNEL阳性细胞。慢性脑缺血1个月、2个月、3个月大鼠脑内TUNEL阳性细胞数明显高于相应假手术组（P＜0．05），随着缺血时间的延长，TUNEL阳性细胞数逐渐增多，缺血3个月时阳性细胞数最多。见图1。

图1 不同缺血时间额叶皮层TUNEL染色

2．2 大鼠不同缺血时间额叶皮层Smac、NAIP表达变化及丁苯酞的影响

RT－PCR结果显示缺血组额叶3个时间点Smac mRNA表达量明显高于假手术组，缺血3个时间点比较Smac mRNA表达量无明显变化。缺血组额叶3个时间点NAIP mRNA表达较假手术组明显降低（P＜0．05），随着缺血时间的延长，NAIP mRNA表达量呈下降趋势，缺血3个月时NAIP mRNA表达量最低。丁苯酞干预组各时间点NAIP mRNA表达量较缺血组明显提高，组间比较差异显著（P＜0．05）。见图2，3。

图2 不同缺血时间Smac GAPDH表达量

图3 不同缺血时间NAIP GAPDH表达量

3 讨论

慢性脑缺血是临床上常见的脑损伤之一，目前非常重视对慢性脑缺血致认知功能障碍防治的研究。目前在慢性脑缺血致认知功能障碍的损伤机制研究中，主要有氧化应激、炎症、神经递质功能障碍及细胞凋亡等因素参与其中。最近关于细胞凋亡调节机制的研究表明Smac和NAIP起重要作用。Smac是存在于线粒体并调节细胞凋亡的蛋白质，其促凋亡作用是通过逆转凋亡抑制蛋白（IAPs）尤其是X连锁凋亡抑制蛋白（xIAP）的作用实现的［1］。凋亡抑制蛋白IAPs家族是近年来发现了一组高度保守的凋亡蛋白抑制因子家族，主要通过抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase），参与肿瘤坏死因子受体（TNFR）介导的信号转导等途径发挥抗凋亡作用，与恶性肿瘤、神经系统病变等密切相关［2］。神经元凋亡抑制蛋白（NAIP）在许多神经系统疾病中发挥重要作用。本研究的前期实验结果显示，慢性脑缺血后大鼠额叶皮层出现典型的凋亡改变。有大量证据表明缺血后神经细胞的死亡受到caspases的调节［3］。本研究在此基础上，对凋亡调控因子Smac、NAIP基因进行检测［4］。本研究结果提示Smac、NAIP参与慢性缺血大鼠脑内神经细胞的凋亡过程［5］，而丁苯酞则可能通过抑制Smac并增强NAIP的作用对神经细胞凋亡发挥神经保护作用［6］，这与Siegelin等的报道［7］相似。

［1］Fan LW，Lin SY，Pang Y，et al．Hypoxia－ischemia induced neurological dysfunction and brain injury in the neonatal rat［J］．Behav Brain Res，2005，165（1）：80．

［2］Shang Y，Cheng JOi，J Miao H．Scutellaria flavonoid reduced memory dysfunction and neuronal injury caused by permanent global ischemia in rats．Phamracol［J］．Biochem Behav，2005，82：67．

［3］Eisel UL，Biber K，Luiten PGM．Life and death of nerve cells：therapeutic cytokine signaling pathways［J］．Curr Signal Transduct Ther，2006，1：133．

［4］Du C，Fang M，Li Y，et al．Smac，a mitochondrial protein that promotes cytochrome－dependent caspase activation by elimination IAP inhibition［J］．Cell，2000，102（1）：33．

［5］Deckwerth TL，Adams LM，Wiessner C，et al．Long－term protection ofbrain tissue from cerebral ischemia by peripherally administered peptidomimeticcaspase inhibitors［J］．Drug Dev Res，2001，52：579．

［6］Antonsson B．Bax and other pro－apoptotic Bcl－2family “killerproteins”and their victim the mitochondrion［J］．Cell Tissue Res，2001，306：347．

［7］Yoo NJ，Kim HS，Kim SY，et al．Immunohistochemical analysis of Smac／IABLO expression in human carcinomas and sarcomas［J］．APMIS，2003，111（3）：382．