小檗碱逆转高糖对血管内皮细胞迁移的抑制作用

李必强，林 威，姚恩辉，林 楠，黄培基

高血糖的内环境可导致血管内皮细胞的功能紊乱，是糖尿病患者血管病变的主要原因之一［1］。流行病学的研究显示，糖尿病与心血管病变的危险性增加密切相关，糖尿病患者较一般患者心肌梗死后所需的恢复时间更长，出现梗死后心绞痛、梗死面积扩大和充血性心力衰竭的风险更大［2］，其原因为糖尿病患者的冠状动脉侧支循环的建立相对减弱，其中，高血糖对内皮细胞功能的负面影响是导致该病理状态的重要因素［3］。

小檗碱又名黄连素，是由中药毛莨科植物黄连的干燥根状茎中提取的一种异喹啉生物碱，已证实可用于代谢综合征相关心血管疾患的治疗［4］。有报道表明，小檗碱可降低高血糖对内皮细胞的损伤，但其具体作用机制尚未得到全面阐明。本研究采用体外培养的永生化的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）EA.hy926细胞为模型，研究小檗碱对高血糖环境下内皮细胞迁移的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 盐酸小檗碱、D－葡萄糖及 MTT（四甲基偶氮唑蓝）及二甲基亚砜（DMSO）（上海生工生物工程有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司），DMEM低糖及高糖培养基（美国Gibco公司，低糖培养基为EA.hy926细胞常规培养使用的含5.6mmol／L D－葡萄糖的DMEM 培养基，高糖培养基为含33mmol／L D－葡萄糖的DMEM培养基）；Non－radioactive EMSA of NF－κB检测试剂盒（TFDET001，美国Viagene公司）。

1.2 方法

1.2.1 血管内皮细胞的培养 HUVEC EA.hy926（中科院上海细胞库）解冻复苏后，培养于含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基，置于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中。血管内皮细胞呈梭形，融合生长时呈多角形单层铺路石样形态排列；当细胞融合生长至80%左右，采用0.25%的胰蛋白酶消化，2～5代以内的细胞用于实验。

1.2.2 样品配制 盐酸小檗碱溶于DMSO，冻存于－20℃保存，临用前以培养液稀释到相应终浓度，DMSO含量为0.5%。实验分4组：D－葡萄糖5.6mmol／L组，即低糖培养组，采用5.6mmol／L的葡萄糖培养基培养EA.hy926细胞；D－葡萄糖33mmol／L组，即高糖培养组，采用33mmol／L的葡萄糖培养基培养EA.hy926细胞；D－葡萄糖33mmol／L＋ 小 檗 碱 2.5 μmol／L 组，即 经 过2.5μmol／L的小檗碱处理过的高糖培养组；D－葡萄糖33mmol／L＋ 小 檗 碱 5μmol／L 组，即 经 过5μmol／L的小檗碱处理过的高糖培养组。

1.2.3 细胞活性测定 将正常生长的内皮细胞胰酶消化稀释后按每孔5×103个接种于96孔板，培养24h后，更换为相应的样品培养液，继续培养48h后，加入 MTT溶液（5mg／mL），每孔10μL，孵育4h，弃培养液，DMSO溶解，酶标仪（570nm）测定吸光度。

1.2.4 划痕试验 参照文献［5］，将EA.hy926细胞培养于24孔板，待细胞生长融合至80%左右时，用200μL微量加样器头在培养板中轻划直线，宽约0.5mm，形成无细胞的裸露区域，采用PBS清洗培养板，将悬浮细胞清除；更换为含2%血清培养基的相应供试溶液，连续观察8h（2%的血清可加速细胞迁移速度，对细胞的增殖作用可忽略不计）。在低倍镜下计数原裸露区域中内皮细胞的迁入数量，用迁入数量与裸露区的面积比值表示细胞迁移率。

1.2.5 核因子－κB（NF－κB）活性测定 电泳迁移率改 变 法 （electrophoretic mobility shift assay，EMSA）测定NF－κB结合活性。以化学发光法检测NF－κB的DNA结合活性，严格按说明书的要求完成相关实验步骤。采用ImageJ 1.47V图像分析软件计算光密度值。

1.3 统计学处理 数据以±s表示。采用 Microsoft Office Excel 2003软件t检验进行数据分析。每次试验相同条件平行处理3～6个样本，重复3次。

2 结 果

2.1 高糖对细胞活性的影响 采用含不同浓度D－葡萄糖的DMEM培养液培养48h后，MTT法检测细胞活性，实验结果显示，2种条件下对EA.hy926细胞的增殖活性并无明显的影响，高糖培养组细胞增殖活性仅略低于低糖培养组，2组差别无统计学意义。

2.2 小檗碱对 EA.hy9 2 6细胞活性的影响10～40μmol／L小檗碱可抑制EA.hy926细胞的增殖，且作用强度与剂量有关，但低于5μmol／L则抑制作用不明显。

2.3 小檗碱逆转高糖对内皮细胞迁移的抑制作用相对于低糖培养基，33mmol／L高糖处理6h后，细胞的迁移率明显降低（P＜0.05），表明高糖培养基可抑制内皮细胞的迁移。然而，采用2.5及5μmol／L小檗碱同时处理后，细胞的迁移率得到一定程度的恢复，表明小檗碱可以逆转高糖培养基对内皮细胞迁移的抑制作用（表1，图1）。

表1 小檗碱对高糖所致EA.hy926细胞迁移抑制作用及NF－κB DNA的结合活性的影响Tab1 Impact of berberine on the migration and NF－κB DNA binding activity in high－glucose treated EA.hy926cells

图1 小檗碱对高糖所致EA.hy926细胞迁移抑制作用的影响（ ×100）Fig1 Impact of berberine on the migration of high－glucose treated EA.hy926cells（ ×100）

2.4 小檗碱抑制高糖诱导的NF－κB活性上调 不同处理条件6h后的EA.hy926细胞NF－κB DNA结合活性的相关实验结果显示，相对于低糖培养基，33mmol／L高糖处理6h后，NF－κB DNA 的结合活性明显增强；然而，采用2.5及5μmol／L小檗碱同时处理后NF－κB DNA的结合活性受到一定程度的抑制，且作用强度与剂量有关（P＜0.01），表明小檗碱逆转高糖培养基对内皮细胞迁移的抑制作用可能与抑制高糖诱导NF－κB DNA的结合活性升高有关（表1，图2）。

图2 小檗碱对 EA.hy926细胞 NF－κB DNA 的结合活性的影响Fig2 Impact of berberine on NF－κB DNA binding activity in EA.hy926cells

3 讨 论

研究证实，糖尿病患者的心血管相关疾病的死亡风险远高于非糖尿病患者［6－7］。糖尿病患者发生冠状动脉病变后，死亡率明显增加，并且更易出现心肌梗死的延展及充血性心力衰竭。有研究表明，合并糖尿病的冠心病患者侧支循环产生的数量明显少于非糖尿病患者，提示高血糖是冠状动脉侧支循环形成的抑制因素［3］。因此，逆转高血糖对冠状动脉侧支循环形成的影响具有重要的临床价值。

血管内皮细胞是覆盖在血管内表面高度分化的单层细胞，是构成血管的重要组成部分，血管内皮细胞的迁移是冠状动脉侧支形成的重要步骤之一［8］。有研究表明，高血糖可抑制HUVEC以及人主动脉内皮细胞（HAEC）的迁移、增殖及血管发生过程［1，9］。本研究采用永生化的 HUVEC EA.hy926研究高糖对内皮细胞迁移的影响，实验结果表明，在33mmol／L D－葡萄糖存在的条件下，相对于5.5mmol／L D－葡萄糖培养条件，EA.hy926的迁移受到明显抑制，该结果与相关的文献报道一致，说明高血糖确为新生血管形成的抑制因素。与以往的报道不同，笔者的实验结果表明，不同浓度D－葡萄糖对EA.hy926活性的影响不大，推测可能与不同来源的细胞株及传代培养条件有关，也说明高糖对内皮细胞活性的影响可能并不是糖尿病类心血管疾病发生的主要原因，与相关文献报道一致。

近年来，有关小檗碱的药理活性研究得到进一步扩展，国内外大量的科研证实小檗碱具有抗肿瘤及抗糖尿病作用［10－11］。有关小檗碱降血糖的作用机制已有较多报道，主要集中在降血糖作用及调节脂代谢作用方面，也有少数研究关注小檗碱对内皮细胞的保护作用，认为小檗碱可以通过NO通路等途径改善内皮细胞功能［12］，但是否能影响内皮细胞的迁移尚未见相关报道。在本研究中，笔者采用不同剂量（2.5，5μmol／L，该浓度条件对 EA.hy926细胞活性没有明显的影响）的小檗碱处理高糖环境下的EA.hy926细胞，实验结果表明，小檗碱可以逆转高糖对血管内皮细胞迁移的抑制作用，且作用强度与剂量有关，表明该作用可能也是小檗碱防治糖尿病性心血管疾病的作用机制之一。

有关小檗碱逆转高糖对血管内皮细胞迁移抑制作用的作用机制研究是基于如下考虑：首先，已有报道指出，NF－κB的激活是高糖抑制内皮细胞迁移的主要因素［9］，此外有研究表明，小檗碱可抑制NF－κB的激活，从而发挥抗炎及抗肿瘤作用［13］；在此基础上，也有研究认为小檗碱通过抑制NF－κB的激活达到对抗高糖对血管内皮细胞的损伤［14］；故推测抑制NF－κB活性可能介导了小檗碱逆转高糖对血管内皮细胞迁移的抑制作用。本研究证实，在体外培养的EA.hy926细胞模型水平，小檗碱可抑制高糖诱导的NF－κB激活，且作用强度与剂量有关，说明小檗碱逆转高糖对血管内皮细胞迁移的抑制作用的作用机制与抑制NF－κB激活密切相关。

综上所述，本研究表明小檗碱可通过抑制NF－κB活性上调逆转高糖对内皮细胞迁移的抑制作用。因此小檗碱不仅可以降低血糖，而且可能通过保护血管内皮的正常生理功能从而达到预防和治疗高血糖相关心血管类疾患的作用；此外，本研究提示以小檗碱为先导化合物开发新型血管内皮细胞保护剂亦具有一定的科研价值。

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