生姜多糖的提取工艺及其抗氧化活性研究

2013-09-28邓胜国尹爱武陈铁壁

湖南科技学院学报 2013年4期

邓胜国尹爱武陈铁壁

（湖南科技学院，湖南永州 425100）

引言

生姜(Zingiber Officinale Rosc.)是姜属植物的块根茎，属国家卫生部首批公布的药食兼用资源之一，是我国重要的调味蔬菜和出口创汇蔬菜[1-2]。研究表明生姜含多种氨基酸、可溶性多糖、姜酚、黄酮等有效成分，具散寒、止呕、健胃解毒、延缓衰老、降低胆固醇、抗癌和抑菌等功效[3-5]。目前对生姜的功能研究主要集中于姜酮、姜醇，而对生姜多糖类化学成分研究甚少，对于生姜多糖单体的提取、纯化、化学结构鉴定及生姜多糖与蛋白质、脱氧核糖核酸等大分子相互作用的机制及生姜多糖抗氧化活性的研究国内外文献报道不多，影响了对生姜活性成分的利用和开发。因此建立生姜多糖初步提取分离条件，研究其清除自由基的作用，以期为后续多糖纯化工序及进一步探明生姜的生理作用机制及其功能食品的开发研究提供优质、有效的及丰富的原材料，提高生姜的综合利用价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

生姜：湖南省永州市零陵区杨梓塘菜市场购买。新鲜生姜洗净、切片于50 ℃烘干，粉碎后加入石油醚通过索式装置抽提至回流液近无色，脱去脂质和色素的生姜粉，放入通风橱中风干，待用。

苯酚 (AR)，浓硫酸 (AR)，95% 乙醇( AR)，葡萄糖 (GR)，抗坏血酸 (食品级)，水杨酸 (AR)，DPPH· (化学纯)。

754紫外可见分光光度计 (上海光谱仪器有限公司) ；FZ-20植物粉碎机 (上海胜启仪器仪表有限公司；TGL - 20M高速台式冷冻离心机 (长沙湘仪离心机仪器有限公司) ；WG-20电热鼓风干燥箱 (天津市泰斯特仪器有限公司)；RE - 52A旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 葡萄糖标准曲线的制备[6]

精密称取在105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖10 mg置于100 mL的容量瓶中，加适量蒸馏水使其溶解，并稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，各加入5%苯酚溶液1.0 mL，混合均匀后加入浓硫酸4 mL，蒸馏水定容，室温放置30 min后，在波长490 nm处测定吸光度(A)。以葡萄糖浓度(C，mg/mL)为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，采用最小二乘法进行线性回归回归，得到标准回归方程A=6.0829C - 0.0011，R2=0.9953，如图1.1。

图1.1 苯酚-硫酸法测定葡萄糖含量标准曲线Fig.1.1 The standard curve of enthrone-sulfate UV absorption used in glucose

1.2.2 生姜多糖的提取及测定

准确称取 5.000g的生姜粉，与一定体积的蒸馏水混合、搅拌均匀，恒温水浴浸提一定时间真空抽滤，滤渣再用相同体积的蒸馏水第二次提取，过滤，合并滤液，浓缩定容至一定的体积供分析用。精密移取生姜多糖提取液2.0 mL于10 mL容量瓶中，按1.2.1的方法同样处理后，在490 nm处测吸光度，根据回归方程计算出提取液中生姜多糖的浓度并计算出生姜多糖的得率。

式中：C为生姜提取液中多糖的质量浓度(mg/mL)，V为生姜提取液的总体积 (mL)，W为准确称取的生姜质量(g)。

1.2.3 多糖提取的单因素实验

1.2.3.1 提取温度对生姜多糖提取率的影响

称取5.000g的生姜粉末分别置于编号为1、2、3、4、5的具塞三角瓶中，加入100 mL蒸馏水，分别在温度为60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃的水浴中恒温提取2.5 h，测定生姜多糖的得率，比较选取最佳提取温度。

1.2.3.2 提取时间对生姜多糖提取率的影响

称取5.000g的生姜粉末分别置于编号为1、2、3、4、5的具塞三角瓶中，加入100 mL蒸馏水，放入90 ℃恒温水浴中分别提取1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，测定生姜多糖的得率，比较选取最佳提取时间。

1.2.3.3 料液比对生姜多糖提取率的影响

称取5.000g的生姜粉末分别置于编号为1、2、3、4、5的具塞三角瓶中，按固液比分别为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25加入蒸馏水，放入90 ℃水浴中提取2.5 h，测定生姜多糖的得率，比较选取最佳料液比。

1.2.4 多糖提取的正交实验

在单因素试验的基础上，对提取温度、提取时间和料液比采用 L9(34) 进行正交试验 (表1.1)，以多糖得率为考察指标，优化生姜多糖的提取工艺条件。

表1.1 生姜多糖提取正交试验因素水平表Tab.1.1 Factors and levels list of orthogonal experiment for polysacchrides extraction

1.2.5 生姜多糖的抗氧化性研究

1.2.5.1 生姜多糖对·O H自由基清除作用(邻菲罗啉法)

参照文献[7]方法操作。向试管中加入一系列不同浓度的生姜多糖溶液1.00mL(空白管则加入1.00mL的蒸馏水)，FeSO4溶液2.00mL, 水杨酸-乙醇1.50 mL，最后加H2O2(0.03%)0.10 mL启动反应，振荡混合，水浴37℃，保温30min, 在波长510 nm 下测量各自的吸光度值。

其中，A0：空白管的吸光度；Ai：为加入自由基清除剂后的吸光度。

1.2.5.2 生姜多糖对DPPH· 的清除能力[27,28]

参照文献[8-9]方法操作。反应体积为4.0 mL，按表2-1加样后，溶液摇匀，室温下静止30 min，乙醇调零，517 nm下测定各吸光值A（用等质量浓度的抗坏血酸代替样品做参照）。清除率 = [1－(Ai－Aj)／A0]×100%

表1.2 DPPH加样实验Table 1.2 The experiment about the addition of the DPPH -Free Radical

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取温度对生姜多糖得率的影响

图2.1 提取温度对生姜多糖得率的影响Fig.2.1 The effect of temperature on extraction rate of crude polysaccharides in zingiberis rhizoma recens

由图2.1可知，随着温度的升高，生姜多糖的得率逐渐增大，温度大于90 ℃后，多糖的提取率增加缓慢。其原因可能是由于温度的升高加速了多糖的扩散和运动而利于多糖分子克服生姜内分子间约束而溶解于水中，致使其提取率上升。当温度超过90 ℃后，水对多糖的溶解度已达到饱和，温度再升高对其提取率影响不明显。考虑到温度升高对设备的特殊要求及防止多糖在高温下发生部分水解等因素，因此选取90 ℃较为合理。

2.1.2 提取时间对生姜多糖得率的影响

由图2.2可知，随着提取时间的延长，生姜多糖的得率呈现增大趋势，但在150 min后多糖的得率几乎保持不变。表明多糖得率和提取时间密切相关，提取时间过短导致提取不充分，而150 min后多糖得率变化趋缓的原因可能是一方面提取时间延长导致生姜多糖在水溶液中溶解和扩散达到平衡，另一方面是高温长时间提取导致其他杂质的溶解量增加，阻碍多糖类物质的溶出。故综合考虑选用150 min较为合适。

图2.2 提取时间对生姜多糖得率的影响Fig.2.2 The effect of extraction time on extraction rate of crude polysaccharides in zingiberis rhizoma recens

2.1.3 液固比对生姜多糖得率的影响

由图2.3可知，当液固比低于20:1时，多糖含量随液固比的增加而提高，但当液固比大于20:1时，多糖含量则略有下降。其原因可能是随着溶剂（水）量增加，多糖的溶解量增加，使生姜多糖的提取率上升；液固比达到20:1时，溶质（多糖）的提取达到平衡，此时多糖的提取率最大；溶剂（水）量增加到一定程度（液固比大于20:1）时，导致多糖的水解速度增加，进而影响多糖的提取率。由于提取液在后续工序中需经浓缩，若初期加水量过大会使后续工序能耗增加，效率降低，因此选择液固比为1:20左右较为适宜。

图2.3 提取时料液比对生姜多糖得率的影响Fig.2.3 The effect of ratio of material to water on extraction rate of crude polysaccharides in zingiberis rhizoma recens

2.2 生姜多糖提取的正交试验

表2.1 多糖提取正交试验结果表Tab.2.1 The orthogonal experiments results of polysaccharides extraction

表2.2 多糖提取方差分析表Tab.2.2 Variance analysis of polysaccharides extraction

空列 0.07280 2 0.03640误差 0.07280 2 0.03640总和 16.2994

由表2.1极差分析可知 ,影响生姜多糖得率的各因素主次关系为：B (料液比) > A(提取温度) > C (提取时间) ，提取温度和料液比均以第三水平为最佳，而提取时间则以第二水平为最好。从表3.2方差分析可知，料液比及提取温度对生姜多糖得率的影响存在着显著差异 (P < 0.01)，但提取时间对生姜多糖得率的影响不显著。因此生姜多糖提取的最优工艺参数组合应为： A3B3C2，即提取温度为90 ℃，提取时间为2.5 h，料液比为1:20。

2.3 生姜多糖抗氧化性研究

2.3.1 生姜多糖对羟自由基（· OH）的清除作用

图2.4 生姜多糖对羟自由基的清除作用Fig.2.4 The hydroxyl radical scavenging potential of crude polysaccharides in zingiberis rhizoma recens

由图2.4可以看出，生姜多糖提取液对由Fenton体系产生的·OH有一定的清除作用，随着生姜多糖提取液浓度的增加，对·OH自由基的清除能力逐渐增强，呈现一定的量效关系。当提取液浓度达到1.0 mg/mL，提取液对羟自由基的清除作用达到48%。

图2.5 生姜多糖对DPPH·自由基的清除作用Fig.2.5 The DPPH radical scavenging potential of crude polysaccharides in zingiberis rhizoma recens

2.3.2 生姜多糖对DPPH·清除能力

IC50值是评价自由基清除剂效果的常用指标。IC50为半数抑制率浓度，即自由基清除率为50%时候自由基清除剂的浓度，其值越小，表示达到50%自由基清除率时，自由基清除剂的浓度剂量越小，其自由基清除效果越好[10]。由图2.5可知，当提取液浓度达到 1.0 mg/mL，对 DPPH·的清除率达到 56%，清除 DPPH·的 IC50为 0.93mg/mL，略小于抗坏血酸的 IC50值(0.85mg/mL)，说明在一定浓度范围内生姜多糖具有较强的清除DPPH·能力。