响应曲面法优化黄芩苷精制工艺研究

冯玉康，赵伯友，姜国志

(神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430)

中药工业

响应曲面法优化黄芩苷精制工艺研究

冯玉康*，赵伯友，姜国志

(神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430)

目的：以黄芩苷粗品为原料，利用响应曲面法优化黄芩苷的精制工艺以得到较高纯度的黄芩苷。方法：在单因素实验的基础上，应用Box-Behnken设计方法建立数学模型，选择乙醇浓度、pH值、保温时间和保温温度为影响因子，以黄芩苷纯度为响应值，进行响应曲面分析。结果：确定黄芩苷的最佳精制工艺条件为：乙醇浓度50%，pH值2.00，保温温度80 ℃，保温时间45 min。在最佳精制工艺条件下黄芩苷的平均纯度为91.13%。结论：精制工艺与模型高度拟合，可以用于工业生产。

黄芩苷；响应曲面法；精制工艺；纯度

黄芩为唇形科植物黄芩ScutcllariabaicalensisGeorgi的干燥根，作为清热解毒的常用中药。其主要有效成分为黄酮类化合物，迄今已分离出约40种黄酮类物质[1]。其中，黄芩苷是主要的有效成分，具有显著的生物活性。它具有清热、降压、镇静、利尿、利胆、抗过敏、抗炎、抗心律失常、抗动脉硬化、防紫外线、抗癌、抗氧化、清除异菌等功效[2-5]。但是现在制药企业使用的黄芩苷的纯度较低，口服制剂的纯度只有83%，这就可能产生潜在的用药危险。为了尽量避免这些危害，本研究主要是利用响应曲面法优化黄芩苷的精制工艺，使黄芩苷达到更高的纯度，从而提高黄芩苷的用药安全性。

1 材料与仪器

1.1 材料

黄芩苷粗品购买于诸城市浩天药业有限公司(含量为83%，用于口服制剂)。

1.2 试药

黄芩苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110715-201117，纯度：91.7%)。

乙醇，分析纯(天津市申泰化学试剂有限公司)；乙醇，色谱纯(Thermo Fisher)；氢氧化钠，分析纯(天津市申泰化学试剂有限公司)；盐酸，药用辅料(湖南尔康制药股份有限公司)。

1.3 仪器

METTLER-ALC-210.4电子分析天平(上海梅特勒托利多仪器有限公司)；UltiMate3000高效液相色谱仪(美国戴安公司)。HH-SB型电热恒温水浴锅(科伟仪器)；five easy系列FE20pH计(上海梅特勒托利多仪器有限公司)；SHB-III循环水式真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；KH3200E型超声清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。

2 方法

2.1 黄芩苷的精制

取黄芩苷粗品若干，加10倍量的纯化水搅拌成混悬液，用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节pH至7.00，加入适量的乙醇，静置过夜后，抽滤，弃去沉淀。滤液用2 mol·L-1的盐酸调节pH值，于不同的水浴温度下保温一段时间，静置冷却至室温后，抽滤。滤饼依次用适量的纯化水，50%的乙醇溶液和95%的乙醇溶液洗涤至洗涤液pH=4.00左右时即可。将滤饼置于60 ℃的真空干燥箱真空干燥4 h即得精制品。

2.2 黄芩苷标准曲线的制作

取黄芩苷对照品25 mg，精密称定，置250 mL容量瓶中，加70%乙醇适量使溶解，再加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，得100 μg·mL-1的黄芩苷对照品溶液。将对照品溶液稀释为10，20，30，40，50，100 μg·mL-1，各取10 μL进液相色谱仪检测，以黄芩苷浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制黄芩苷标准曲线，得回归方程为Y=33.87X-36.564，r=0.999 9。

2.3 黄芩苷含量测定方法[6]

2.3.1 色谱条件和系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)为流动相，检测波长为276 nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3 000。

2.3.2 对照品溶液的制备 取黄芩苷对照品适量，精密称定，置100 mL量瓶中，加70%乙醇适量使溶解，加流动相1 mL，再加70%乙醇稀释至刻度，摇匀；精密量取5 mL，置10 mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1 mL中含黄芩苷50 μg)。

2.3.3 供试品溶液的制备 取本品10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加70%乙醇适量使溶解，加流动相1 mL，再加70%乙醇稀释至刻度，摇匀；精密量取5 mL，置10 mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.4 单因素实验

2.4.1 乙醇浓度 精制过程中设定盐酸调节的pH值为2.00，保温温度设定为80 ℃，保温时间设定为30 min，乙醇的浓度依次调节为40%、50%、60%、70%。依2.1进行精制，样品按2.3测定。

2.4.2 pH值 精制过程中设定乙醇的浓度为50%，保温温度设定为80 ℃，保温时间设定为30 min，盐酸调节的pH值依次调节为1.00，2.00，3.00，4.00。按2.1进行精制，样品按2.3测定。

2.4.3 保温温度 精制过程中设定乙醇的浓度为50%，盐酸调节的pH值设定为2.00，保温时间设定为30 min，保温温度依次调节为60，70，80，90 ℃。按2.1进行精制，样品按2.3测定。

2.4.4 保温时间 精制过程中设定乙醇的浓度为50%，盐酸调节的pH值设定为2.00，保温温度设定为80 ℃，保温时间依次调节为15，30，45，60 min。按2.1进行精制，样品按2.3测定。

2.5 响应曲面试验

在单因素实验结果的基础上，根据Box-Behnken的中心组合设计原理设计自变量，以黄芩苷纯度为响应值，通过响应曲面分析(Response Surface Analysis，RSA)进行黄芩苷精制工艺条件的优化。

2.6 验证实验

利用响应曲面软件分析所得的最佳实验条件进行3次试验，分别测定黄芩苷的纯度，得到黄芩苷的实际平均纯度，并计算与模型给出的理论值的相对偏差。

3 结果与分析

3.1 单因素实验结果

单因素实验对黄芩苷精制效果的影响趋势如图1所示。

A.乙醇溶液浓度 B.pH值 C.保温温度 D.保温时间图1 单因素实验结果

3.1.1 乙醇浓度对精制黄芩苷纯度的影响 由图1A可以看出，乙醇含量为50%时黄芩苷的纯度最高，分析原因为黄芩苷类物质在形成钠盐后溶于50%的乙醇溶液，不能溶解于该溶液的杂质就会析出。乙醇浓度低，脂溶性杂质析出增加，乙醇浓度高，水溶性杂质析出升高。选用50%的乙醇浓度能很好地除去水溶性和脂溶性的杂质。

3.1.2 pH值对精制黄芩苷纯度的影响 由图1B可以看出，黄芩苷的纯度随着pH值的升高而出现先升高后降低的趋势，这和潘燕[7]研究的结果相符，分析原因为黄芩苷具有多酚羟基结构，性质不稳定，易被氧化，且在酸性条件(pH<2.00)下可发生一定程度的氧化或水解，从而使得黄芩苷的纯度降低。

3.1.3 保温温度对精制黄芩苷纯度的影响 由图1C可以看出，黄芩苷的纯度保温温度的升高而出现先升高后降低的趋势，分析原因为保温温度只是促进黄芩苷钠盐向着黄芩苷转变，保温温度的升高加速了反应的速度，在较短时间内水解和氧化的破坏较低，温度对纯度的影响也就降低到了最低。综合考虑，选择80 ℃为最佳的保温温度。

3.1.4 保温时间对精制黄芩苷纯度的影响 由图1D可以看出，黄芩苷的纯度在保温时间45 min后增加变缓，进入平台期，分析原因为随着时间的增加，少部分的黄芩苷在长时间的加热和酸性条件下出现了水解和氧化。综合考虑选用45 min为最佳保温时间，这样既能使得黄芩苷的反应完全，而且黄芩苷的损失也相对减少，纯度也能得到很好的保障。

3.2 精制工艺的响应面法优化

3.2.1因素选择 根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，综合单因素实验结果，选取乙醇浓度X1、溶液pH值X2、保温时间X3和保温温度X4对黄芩苷精制纯度率影响显著的4个因素，用Y表示黄芩苷的纯度，在单因素实验的基础上采用4因素3水平的响应曲面分析法进行实验设计，因素与水平选择见表1。

表1 中心组合实验因素和水平

3.2.2 响应曲面试验 利用Design-Expert8.0.6软件进行试验设计。本次试验共含有27个试验点，其中24个为析因点，3个为零点。析因点为自变量取值在所构成的三维顶点，零点为区域的中心点，其中零点试验重复3次，用以估算试验误差。Box-Behnken实验方案及结果见表2。

表2 响应曲面法实验方案及结果

3.3 模型的建立及其显著性检验

利用Design-Expert8.0.6软件对表2试验数据进行多元回归拟合，得到黄芩苷纯度(Y)对乙醇浓度(X1)、pH值(X2)、保温时间(X3)和保温温度(X4)二次多项回归模型为：

对该模型进行方差分析，得出回归模型系数显著性检验结果见表3。

表3 响应曲面二次回归方程方差分析

注：*P<0.05，**P<0.01

由表3响应曲面二次回归方程方差分析结果可知，试验所选模型P<0.000 1，表明回归模型极其显著，失拟项P=0.549 5>0.05表明差异没有统计学意义，说明数据中没有异常点，不需要引入更高次数的项，校正拟合系数(Adj R-Squared)为0.897 3，表明响应值(黄芩苷纯度)变化的89.73%来自于所选变量。

说明该模型拟合程度良好，试验误差小，信噪比(Adeq Precision)为15.604，大于4，这些充分证明可用此模型来分析和预测精制黄芩苷工艺的结果[8]。

模型系数显著性检验结果可知，模型的一次项A、B、C达到显著水平(P<0.05)，其中B(P<0.01)对黄芩苷精制的线性效应显著，二次项A2、B2和D2达到显著水平(P<0.05)，其中A2、B2(P<0.01)，对黄芩苷精制的曲面效应显著，交互项BC都达到极显著水平(P<0.01)，交互作用显著。由此可知，在本试验设计范围内，乙醇浓度、pH值、保温时间这3个因素对黄芩苷精制的线性效应和曲面效应都显著，且pH和保温时间之间有较强的交互作用。

3.4 响应曲面分析

图2 Y=f(A，B)的响应曲面和等高线

根据曲面模型模拟出的等高线和曲面，考察模型的拟合程度，分析各个因素对黄芩苷精制过程的影响程度，交互作用的模拟等高线和曲面图中发现AC，AD，BD，CD的等高线和曲面图AB(见图2)相似，等高线的形状为圆形，表示交互效应较弱，而这一点也可以从响应曲面二次回归方程方差分析表中得到印证。AB，AC，AD，BD，CD的P值均大于0.05，属于交互作用不明显。而BC的等高线和曲面如图3所示，等高线为椭圆形，表示交互效应显著，从响应曲面二次回归方程方差分析表的P值也得到印证。结合表3分析得出结论，各个因素对黄芩苷精制工艺的影响程度关系为B(pH值)>C(保温时间)>A(乙醇浓度)>D(保温温度)。

图3 Y=f(B，C)的响应曲面和等高线

3.5 响应曲面优化黄芩苷精制工艺条件

利用Design-Expert 8.0.6软件，预测的黄芩苷精制最佳工艺为：乙醇浓度51.58%，pH值2.18，保温时间43.45 min，保温温度81.60 ℃。在最佳精制工艺条件下，黄芩苷的理论最高纯度可以达到91.461 4%。

3.6 响应曲面模型的验证

为了全面检验响应曲面优化精制黄芩苷工艺所得结果的可靠性，同时为了配置和计时方便，将提取工艺参数调整为：乙醇浓度50%，pH值2.00，保温时间45 min，保温温度80 ℃，并在此条件下连续进行了3次实验，黄芩苷的纯度经检测分别为91.10%，91.05%和91.25%，平均值为91.13%，RSD=0.1%。结果表明基于响应曲面法所得的优化提取条件准确可靠。

4 结论

利用软件Design-Expert 8.0.6软件，通过响应曲面分析，得到了各因素的最佳值：乙醇浓度为50%，pH值为2.00，保温时间为45 min，保温温度为80 ℃。验证实验结果表明，黄芩苷精制所得的平均纯度为91.13%。实验为黄芩苷精制工艺提供了技术支持，也使制药企业生产注射用黄芩苷原料质量得到提升，降低了黄芩苷的用药风险。

[1] 董学畅，韩勇，杨海英，等.黄芩苷标样制备及其固相萃取-HPLC测定研究[J].云南化工，2005，2(4)：28-31.

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StudyonOptimizationofExperimentalConditionsofBaicalinPurificationTechniquebyResponseSurfaceMethodology

FENG Yu-kang*，ZHAO Bo-you，JIANG Guo-zhi

(ShinewayPharmaceuticalGroupCo.Ltd.，Shijiazhuang051430，China)

Objective：In order to get higher purity baicalin from Baicalin crude，Response Surface Methodology(RSM)is employed to optimize experimental conditions of baicalin purification.Methods：Based on the single factor experiments，Box-Behnken design was applied to establish the mathematical model.The optimum purification process was investigated by response surface methodology with ethanol concentration，pH value，holding temperature and holding time as influencing factors，and the product purity of baicalin was considered as index.Results：The results of RSM suggested the best experimental conditions were：ethanol concentration 50%，pH value 2.00，holding temperature 80 ℃，holding time 45 min.The average product purity of baicalin was 91.13% under above conditions.Conclusion：The optimum purification process was in good agreement with the predicted counterpart，and can be used for industrial production

Baicalin； Response Surface Methodology(RSM)； Refining technology； Purity

2012-11-10)

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冯玉康，E-mail：science123@yahoo.cn