内皮型一氧化氮合酶基因多态性与突发性耳聋关系的研究＊

樊 军，张晓进，石 磊

（1.天津港口医院耳鼻咽喉科，天津 300456；2.新疆医科大学第一附属医院医学检验中心，新疆乌鲁木齐 830054；3.天津公安医院耳鼻喉科，天津 300040）

突发性耳聋（sudden sensorineural hearing loss，SSHL）是一种突然发生的原因不明的感音神经性听力损失性疾病。一氧化氮是一种具有广泛生物活性的小分子化合物，可作为介质、信使或细胞功能调节因子参与体内一系列生理和病理过程，一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）是一氧化氮合成的限速酶，调节一氧化氮的合成，对一氧化氮生物功能的发挥起着非常重要的作用［1］。近年来，人们已证明了一氧化氮对耳蜗神经的毒性作用，在SSHL的发病过程中，一氧化氮的神经毒性作用占首位。内皮型NOS（endothelial NOS，eNOS）基因存在多态性［2］，eNOS基因第4内含子的27bp可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeats，VNTR）插入／缺失多态性（4b／a）是决定血管壁一氧化氮基础水平最重要的基因位点。本文探讨了SSHL患者eNOS基因4b／a多态性的分布、频率及其与SSHL的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2008年3月至2010年3月天津港口医院和天津公安医院的耳鼻咽喉科门诊的SSHL患者150例。按是否有合并症将患者分为合并症组（患者合并糖尿病、心血管疾病或脂代谢疾病）及无合并症组（患者无合并症）。合并症组78例，男44例，女34例；无合并症组72例，男40例，女32例。入选患者年龄30～70岁，平均（51.81±8.12）岁；发病至治疗时间为2d～3个月。选择同期无SSHL、糖尿病、心血管疾病或脂代谢疾病的52例健康人作为对照组，男31例，女21例；年龄30～70岁，平均（52.22±7.41）岁。

1.2 主要试剂和仪器 主要试剂：Tripure分离液（美国Sigma公司）、DNA提取试剂盒（美国Promega公司）、PCR反应试剂盒（大连宝生物工程有限公司）。主要仪器：PE-480型热循环仪（美国Perkin Elmer Cetus公司）、凝胶电泳仪（北京市六一仪器厂）、紫外透射分析仪（美国UVP公司）。

1.3 标本采集 各组人员在采血前禁食12h，次日清晨抽空腹肘正中静脉血2mL，分离出的血清置于-20℃储存备用。

1.4 基因检测

1.4.1 基因组DNA的提取 采用Tripure分离液及DNA提取试剂盒抽提患者血清DNA；（2）PCR扩增目的基因片断，引物序列：上游5′-AGG CCC TAT GGT AGT GCC TT-3′，下游5′-TCT CTT AGT GCT GTG GTC AC-3′［3］。PCR扩增条件：94℃预变性3min，92℃变性30s，58.5℃退火1min，72℃延伸45s，扩增35个循环；72℃延伸7min。

1.4.2 基因型的确定 产物在2%琼脂糖凝胶中电泳分离，溴化乙锭染色，紫外灯下确定其基因型。

1.5 统计学处理 采用SPSS10.0软件包进行统计学分析，计量资料用表示，基因型和等位基因频率的比较采用χ2检验，两样本均数的比较采用t检验，多个样本均数的比较采用方差分析和q检验。基因型和等位基因的相对危险度以比值比（odds ratio，OR）及95%可信区间（confidence interval，CI）表示，采用非条件Logistic回归分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基因型分析 无合并症组患者血清中没有扩增出4a／a基因型，而对照组和合并症组患者的基因型中涵盖4a／a、4b／b、和4b／a 3种基因型，见图1。

图1 eNOS基因第4内含子基因型分布的电泳图

2.2 eNOS基因第4内含子与SSHL的关系 合并症组患者的3种基因型分布与无合并症组比较，差异有统计学意义（χ2=3.55，P＜0.05）。无合并症组、合并症组患者的3种基因型分布分别与对照组比较，差异有统计学意义（χ2=3.65，P＜0.05；χ2=6.44，P＜0.05）。合并症组患者的2种等位基因（4b、4a）与无合并症组比较，差异有统计学意义（χ2=2.99，P＜0.05）。合并症组患者的4b／b、4b／a、4a／a基因型所占比例分别为48.85%（64／131）、66.67%（10／15）、100.00%（4／4），4b和4a等位基因合并症的患病率分别为50.71%（71／140）和70.00%（7／10），二者的OR（4b／4a）为4.02，95%CI为1.48～7.65（P＜0.05）。以上结果表明eNOS 4a等位基因是SSHL患者发生合并症的危险因素，见表1。

表1 各组eNOS基因第4内含子基因型及等位基因的分布和频率

3 讨 论

eNOS基因第4内含子的27bp VNTR多态性是由于重复次数不同形成3种等位基因而产生，其中，重复4次为等位基因a，重复5次为等位基因b，他们是决定一氧化氮基础水平最重要的基因位点［4］。目前，在耳科领域有关一氧化氮的研究取得了很大的成果。一氧化氮除了作用于内皮外平滑肌细胞使血管扩张外，还能抑制血管内血小板的凝集，这2个功能有助于维持耳蜗持续的血液灌注［5］。一氧化氮是在NOS的作用下由体内L-精氨酸转化而来，一氧化氮通过鸟苷酸环化酶中铁原子的作用，激活鸟苷酸环化酶，使细胞内鸟苷酸环化酶含量升高，血管平滑肌舒张［6］。一氧化氮在内耳的血液循环中也发挥重要作用，它产生于血管的内皮细胞和平滑肌细胞，并调节前庭、耳蜗的血流［7］。在SSHL发病过程中，一氧化氮的神经毒性作用占首位［8］。eNOS基因第4内含子的27bp VNTR多态性是决定一氧化氮基础水平的关键基因位点［9-10］，故笔者提出eNOS基因第4内含子的27bp VNTR多态性可能作为诊断SSHL的候选基因。

本课题在研究eNOS基因第4内含子基因型及等位基因的分布和频率中发现，带a等位基因比不带a等位基因的SSHL患者的合并症患病率高，可见eNOS 4a等位基因是SSHL患者发生合并症的危险因素。eNOS基因第4内含子的27bp VNTR多态性是决定血管壁一氧化氮基础水平最重要的基因位点。

总之，eNOS基因与SSHL的关系研究为临床诊疗SSHL提供了新思路，为进一步阐明SSHL的病因奠定了基础。

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