载20（S）－人参皂苷白蛋白纳米微球对人宫颈癌Hela细胞生长抑制作用研究

陈道桢，王常在，陈万瑛，李向东，刘 楼，张 婷，陈 钰，邹 萍

（1.南京医科大学附属无锡妇幼保健院，江苏 无锡214002；2.新疆阿合奇县人民医院，新疆克州843500）

近年来，国内外大量的研究已证明20（S）－人参皂苷Rg3在肿瘤治疗方面有广阔的应用前景［1－3］。但传统制剂的临床应用目前仍存在不少问题，如颗粒偏大、不溶于水，生物利用度较低等等，极大限制了其临床应用。本研究采用纳米技术，制备了载20（S）－人参皂苷白蛋白纳米微球并观察了载20（S）－人参皂苷白蛋白纳米微球（SPG－Rg3－HAS－NP）对人宫颈癌Hela细胞体外增殖抑制作用。

1 材料和方法

1.1 试剂

人宫颈癌Hela细胞株购于武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；20（S）－人参皂苷Rg3购自上海纯优生物科技有限公司，纯度≥97%，人血清白蛋白购自上海生工生物科技有限公司：胎牛血清和RPMI1640培养基为美国Gibco BRL公司产品，二甲基亚砜（DMSO）为Sigma公司产品，四甲基偶氮唑蓝（MTT）为美国Pharmingin公司产品，用磷酸盐缓冲液（PBS）溶解成5g/L，避光储存于4℃；其余试剂均为市售分析纯。

1.2 主要仪器

BS－110S型电子天平（德国Sartorius公司），GL－2型恒温加热磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司）.；SB5200型超声波（上海Branson公司），MM1微型振荡器（上海精密生化仪器厂），CO2培养箱（三洋公司），B10－Rad 550酶标仪（日本）。

1.3 细胞培养

人宫颈癌Hela细胞用RPMI1640培养基培养，各培养液中均常规加入10%胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100mg/ml。

1.4 SPG－Rg3的配制

将SPG－Rg3粉末用DMSO溶解，用含10%新生胎牛血清的RPMI1640培养液稀释成实验所需的各种不同浓度，DMSO终浓度＜0.01%。

1.5 载20（S）－人参皂苷白蛋白纳米微球（SPGRg3－HAS－NP）制备

采用乳化热固化法制备载20（S）－人参皂苷白蛋白纳米微球，该法正在申报国家专利。同时制备空白白蛋白纳米粒（HAS－NP）［4］。纳米粒使用前均经60钴辐射消毒备用。

1.6 MTT实验

①实验分组：A：生理盐水对照组；B：空白白蛋白纳米粒（HAS－NP）组；C：20（S）－人参皂苷组（SPG－Rg3）；D：载20（S）－人参皂苷白蛋白纳米微球组（SPG－Rg3－HAS－NP）；其中B和D组白蛋白浓度一致，C和D组SPG－Rg3药物浓度一致。②用药浓度（按照所包 Rg3计算）：10、20、40、80、160 μg/ml。③观察时间：给药后24h、48h、72h和96 h 4个时间点。④MTT实验：将人宫颈癌Hela细胞接种于96孔细胞培养板 （1.5×104个细胞/孔），置37℃5%CO2培养箱培养；24h后，待细胞贴壁生长良好时，按照是实验分组给药，每个浓度级设3个复孔。给药后分别继续培养24h、48h、72h和96h，每孔加入MTT溶液50μl（1mg/ml），继续培养4h；加入150μl/孔DMSO溶解沉淀，微型振荡仪振荡10min混匀，用酶标仪测定490nm波长吸光度（OD）值，取3孔吸光度平均值。以不加任何细胞的一孔为空白调零，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率＝（1－实验组OD值/对照组OD值）×100%。

1.7 统计学方法

用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料数据以均数±标准差表示，多个样本均数间的两两比较采用方差分析q检验；多个实验组与一个对照组均数间的比较采用方差分析q’检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 空白白蛋白纳米粒的细胞毒性

实验结果显示，在24h、48h、72h和96h4个时间点，空白白蛋白纳米粒（HAS－NP）组对Hela细胞的抑制率与生理盐水组相比，无统计学意义（P﹥0.05），与SPG－Rg3组和 SPG－Rg3－HAS－NP组相比，有统计学意义（P＜0.05），故可以认为不含药白蛋白纳米微球对Hela细胞无明显细胞毒作用，且不具有时间和浓度依赖性。故可认为这种抑制Hela细胞生长作用是由于SPG－Rg3或SPG－Rg3－HASNP释放出的SPG－Rg3作用的结果造成的。

2.2 Hela细胞生长抑制率与药物浓度和作用时间相关性

MTT法检测Hela细胞生长抑制率与药物浓度和作用时间相关性结果见（图1和图2）。从图可以看出，给药24h、48h、72h和96h后，SPG－Rg3和SPGRg3－HAS－NP组的细胞生长抑制率均与给药浓度呈正相关，且随着作用时间的延长，细胞抑制率仍继续增加。说明Hela细胞生长分别与两组药物的给药浓度和时间呈一定的浓度依赖性和时间依赖性。

2.3 Hela细胞生长抑制率的组间差异比较

图3A和3B显示，在24h、48h时SPG－Rg3组各浓度值下的细胞抑制率高于SPG－Rg3－HAS－NP组细胞抑制率，但两组细胞抑制率相比无统计学意义（P＞0.05）；而在72h后，SPG－Rg3－HAS－NP组在各个浓度点的细胞抑制率均明显超过SPGRg3组的细胞抑制率，且两组细胞抑制率相比有统计学意义（P＜0.05）（图3C）；SPG－Rg3组在80μg/ml浓度以后似已进入平台期甚至出现曲线下行的趋势，而SPG－Rg3－HAS－NP组的细胞生长抑制曲线仍继续上升，72h后于20μg/ml浓度处抑制率已超过SPG－Rg3组（P＜0.05）（图3C、3D）。实验结果显示SPG－Rg3－HAS－NP组药物对Hela细胞的抑制有一定的时间延续性，表明药物具有一定的缓释作用。

图1 Hela细胞生长抑制率与SPG－Rg3浓度和作用时间的相关性

图2 Hela细胞生长抑制率与SPG－Rg3－HAS－NP浓度和作用时间的相关性

图3 不同时间点SPG－Rg3与SPG－Rg3－HAS－NP浓度和细胞生长抑制率的相关性

3 讨论

纳米药物是指以纳米级高分子纳米粒（nanoparticles，NP）或纳米球（nano－spheres，NS）、纳米囊（nano－capsules，NC）等为载体，与药物以一定方式结合在一起后制成的药物［5］。运用纳米技术的药物可以克服传统药物许多缺陷以及无法解决的问题。与常规药物相比，纳米药物颗粒小、表面反应活性高、活性中心多、催化效率高、吸附能力强，因此，它具有许多常规药物不具备的优点［6］：①能增大药物溶解度和吸收利用度，减少药物用量，减轻或消除毒副作用并节省药物资源。②纳米颗粒作为生物大分子的载体，能改善蛋白质、多肽类大分子等口服药物的吸收和生物利用度。③纳米药物可以实现缓释、控释和靶向治疗。目前，已有多篇文章报道，将传统药物纳米化后，药效大大提高，在抗肿瘤研究中显示了充分的优越性。如紫杉醇纳米颗粒能明显减小肿瘤体积，延长动物存活时间，与等剂量的游离型紫杉醇相比，抗肿瘤活性显著增强［7］。纳米化的砒霜和雄黄与传统剂型相比，抗肿瘤疗效均明显增强［8］。

本研究采用MTT法观察了给予不同浓度20（S）－人参皂苷和载20（S）－人参皂苷白蛋白纳米微球在不同时间点对人宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用。结果显示，SPG－Rg3和SPG－Rg3－HAS－NP对宫颈癌Hela细胞均具有显著的细胞生长抑制作用，且Hela细胞生长分别与两组药物的给药浓度和时间呈一定的浓度依赖性和时间依赖性。SPG－Rg3组在80μg/ml浓度以后似已进入平台期甚至出现曲线下行的趋势，而SPG－Rg3－HAS－NP组的细胞生长曲线仍继续上升，72h后于20μg/ml浓度处抑制率已超过SPG－Rg3组（P＜0.05）。提示SPGRg3－HAS－NP组药物对Hela细胞的抑制有一定的时间延续性，表明载20（S）－人参皂苷白蛋白纳米微球具有一定的缓释作用。这与白蛋白分子的空间结构以及白蛋白纳米微球的生物特性有很大的关系。白蛋白分子中的氨基酸以肽键相连，且扭曲成团装，具网状空隙，有利于携带20（S）－人参皂苷药物，同时白蛋白由于有较低的免疫原性和可生物降解的特点，可致载20（S）－人参皂苷白蛋白纳米微球具有缓释药物的特点［9］。

由于体内外环境的巨大差异，本实验只初步检测了20（S）－人参皂苷和载20（S）－人参皂苷白蛋白纳米微球在体外对Hela细胞的生长抑制作用的药效作用方面是否有明显减损，与原药相比，载20（S）－人参皂苷白蛋白纳米微球在药物缓释和生物利用度方面具有一定的优势，但难以体现其更多的剂型优势，比如载药白蛋白纳米微球在动物体内的组织滞留性以及靶器官的药物浓度和作用时间等方面都需要在今后的体内试验中进一步加以研究。治疗。

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