Cry1Ab 蛋白在蜘蛛体内的富集及对蜘蛛相关酶活性的影响

周 颖，魏宝阳，王 智，李超民，罗翔宇，肖安琪

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙410128）

自1996年，全球第一例转基因作物在美国开始商品化种植生产以来，转基因作物就开始大面积推广，到2011年全世界转基因作物种植面积由2010年的14 800 万hm2增加8.1%达到16 000 万hm2[1]。2009年我国农业部批准了2 个抗虫转基因水稻品系的安全证书后[2-4]，Bt 作物更是得到广泛的关注。Harwood 等[5]研究表明，转Bt 基因玉米中的Cry1Ab 蛋白可通过食物链的传递转移到玉米地中的相关天敌玉米跳甲、日本金龟子等动物的体内。姜永厚等[6]研究表明，取食转Bt 水稻的褐飞虱（Nilaparvata lugens）、稻蚜（Sitobion avenae）以及用取食转Bt 水稻的二化螟或稻眼蝶幼虫喂食的拟水狼蛛（Pirata subpiraticus）体内都能检测出Cry1Ab 蛋白，这些研究都表明Bt 蛋白能够随着食物链进行传递。但是，Bt 蛋白随着食物链进行传递过程中在蜘蛛体内的富集情况、时间效应以及对蜘蛛体内的相关的酶活性的影响还有待研究。以拟环纹豹蛛为主要试验材料，研究了Cry1Ab 蛋白在蜘蛛体内的富集及对蜘蛛相关酶活性的影响，以期为转Bt 水稻安全性评价提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 供试水稻 转Cry1Ab 基因水稻汕优63（简称Bt 水稻）与对照品种亲本汕优63 均由湖南师范大学提供，Bt 水稻和对照品种在湖南农业大学实验室内盆栽进行培养。水稻在生长期内不喷洒任何农药，其他管理均为常规管理。

1.1.2 供试稻飞虱 以湖南省农科院水稻所试验田捕捉的褐飞虱为材料，在实验室盆栽水稻中进行培养，对照组取食对照水稻，试验组取食Bt 水稻。

1.1.3 供试蜘蛛 拟环纹豹蛛采集于湖南农业科学院水稻所试验田，采回后分装于试管内，饥饿48 h 后分别以取食10～15 d 的对照组（即普通汕优63水稻）和试验组（即Bt 水稻）盆栽水稻的褐飞虱进行饲养，提供充足的稻飞虱和水，在温度25℃、湿度70%的人工气候箱内进行喂养。喂食褐飞虱5、10、15 d 后的蜘蛛在冰水中用匀浆器进行匀浆后，4 000 r/min 离心，取上清液作为酶源。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计 试验设2 个处理，蜘蛛饥饿48 h 后，试验组以取食10～15 d Bt 水稻的褐飞虱饲养，对照组以取食10～15 d 普通汕优63 水稻的褐飞虱饲养。试验期间提供充足的稻飞虱和水，在温度25℃、湿度70%的人工气候箱内进行喂养。喂食褐飞虱5、10、15 d 后的蜘蛛在冰水中用匀浆器进行匀浆后，4 000 r/min 离心，取上清液作为酶源。

1.2.2 数据测定 （1）蜘蛛体内可溶性蛋白的测定：可溶性蛋白采用考马斯亮G-250 法[7]，以牛血清蛋白做蛋白制备标准曲线。（2）酶活力的测定：乙酰胆碱酯酶（AchE）活力测定参照高希武[8]的方法，超氧化物歧化酶（SOD）活力和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力用南京建成公司生产的相关试剂盒进行测定，测定严格按照试剂盒说明操作。（3）Bt蛋白含量的测定：Bt蛋白含量测定采用由美国Agdia 公司提供的Bt-Cry1Ab/Ac ELISA 平板试剂盒测定。

1.2.3 数据分析 所有数据均用SPSS 17.0 软件进行统计分析，用Excel 2003 作图。

2 结果与分析

2.1 稻飞虱和蜘蛛体内Cry1Ab 蛋白含量的变化

由表1 可知，取食Bt 水稻后，在0～5 d 内，褐飞虱体内的Bt 蛋白含量很低，几乎没有检测到，在5～15 d 内，褐飞虱体内的Bt蛋白含量逐渐上升，在第15 天时到达最高。故研究采用取食Bt 水稻10～15 d 内的褐飞虱喂食蜘蛛。

表1 褐飞虱、拟环纹豹蛛体内Cry1Ab 蛋白含量

喂食取食Bt蛋白10 d 的稻飞虱后，在5～15 d内，蜘蛛体内均检测到Bt蛋白含量，在第10 天Bt蛋白含量达到最高，10 d 后呈逐渐下降趋势，但在第15 天时，蜘蛛体内的Bt 蛋白含量仍高于第5 天时的水平。蜘蛛体内Bt蛋白的最高含量高于稻飞虱体内Bt蛋白的最高含量，说明Bt蛋白沿“Bt 水稻—稻飞虱—蜘蛛”这一条食物链传递时具有生物富集效应。

2.2 蜘蛛体内相关酶活力的变化

2.2.1 AchE 活力的变化 如表2 所示，在喂食含有Bt蛋白的稻飞虱5 d 后，试验组拟环纹豹蛛体内的AchE 活力较对照组的出现了略微升高；在喂食10 d 后，当拟环纹豹蛛体内的Bt蛋白含量达到最高值时，试验组拟环纹豹蛛体内的AchE 低于对照组；在喂食15 d 时，试验组拟环纹豹蛛体内的AchE 活力高于对照组，但没有达到显著性差异（P>0.05）。由此推测，AchE 活力的变化可能与Bt蛋白的含量存在负相关性。

表2 Cry1Ab 蛋白富集作用对拟环纹豹蛛体内酶活力的影响 （U/mg）

2.2.2 SOD 活力的变化 如表2 所示，在喂食含有Bt 蛋白的褐飞虱5 d 后，试验组拟环纹豹蛛体内的SOD 活力较对照组的略低，可能是Bt蛋白的富集对蜘蛛体内的酶活力出现了抑制作用；在喂食10 d 后，拟环纹豹蛛体内的Bt蛋白含量处于最高值，试验组拟环纹豹蛛体内的SOD 活力高于对照组，由于Bt蛋白的富集，造成蜘蛛体内自由基含量较多，SOD 对其进行消除；在喂食15 d 时，试验组拟环纹豹蛛体内的SOD 活力均低于对照组，可能是由于Bt蛋白的富集造成整个拟环纹豹蛛体内的SOD 活性无法调控，从而抑制酶活力。但是，在整个试验期间试验组的拟环纹豹蛛体内的SOD 活力与对照组相比，均没有达到显著性差异（P>0.05）。

2.2.3 GSH-Px 活力的变化 如表2 所示，在喂食含有Bt蛋白的稻飞虱5 d 后，试验组拟环纹豹蛛体内的GSH-Px 活力略高于对照组；但在喂食10 d后，拟环纹豹蛛体内的Bt蛋白含量达到最高值时，试验组拟环纹豹蛛体内的GSH-Px 活力低于对照组，且存在极显著性差异（P<0.01）。这可能是由于蜘蛛体内的保护机制开始能够消除Bt蛋白对拟环纹豹蛛体内酶活力的影响，但由于Bt蛋白的大量富集，超出了保护机制的范围，导致酶活力受到抑制。在喂食15 d 后，试验组拟环纹豹蛛体内的GSH-Px活力仍然低于对照组，说明GSH-Px 活力的恢复需要一定的时间。由此推测，GSH-Px 活力的变化可能与Bt 蛋白的含量存在负相关性。

3 讨 论

该研究中Bt 蛋白能够随着“Bt 水稻—稻飞虱—蜘蛛（拟环纹豹蛛）”食物链进行传递，并具有生物放大效应；拟环纹豹蛛体内的Bt 蛋白含量随着时间变化而变化，当Bt 蛋白增长到一定的程度后，逐渐出现下降的趋势，这和陈茂等[9]研究结果一致，可能与蜘蛛体内存在相关保护机制有关，其具体机理还有待进一步研究。

Bt 蛋白在蜘蛛体内的富集造成蜘蛛体内相关酶活力的变化。喂食5 d 时，Bt 蛋白含量开始在体内积累，蜘蛛体内相关的保护酶，主要是GSH-Px活力升高，来抵御Bt 蛋白的影响，同时蜘蛛体内的AchE 活力也升高，通过在神经方面的某些调控作用来对Bt 蛋白活力起到防御作用；而SOD 活力下降，可能是由于Bt蛋白对其产生抑制作用所致。随着Bt 蛋白的持续积累，在喂食10 d 后，蜘蛛体内的AchE 和GSH-Px 活力出现最低值，其中GSHPx 活力与对照组差异达极显著水平，可能是因为Bt 蛋白的持续作用超出酶活力能够调控的范围，使酶活力反而受到抑制；而SOD 活力在此时升高，可能是由于大量Bt 蛋白积累，激活了其体内防御机制所致。之后，蜘蛛体内的防御机制导致Bt 蛋白含量下降，GSH-Px 和AchE 活力开始不断恢复，在喂食15 d 时均还略高于对照组。

在该研究中，酶活力的变化情况和张志罡等[10]报道的Cry1Ab 蛋白对稻纵卷叶螟幼虫体内AchE活力先迅速上升后有剧烈下降趋势，以及SOD 先稳定平缓后急剧升高又迅速下降趋势不一致；和郭文娟等[11]报道的基因水稻对大螟幼虫体内3 种保护酶的变化情况以及张雁等[12]报道的转Bt 基因南林895 杨对杨扇舟蛾体内酶的变化情况均不相同，这可能是由于Bt 蛋白对靶标生物和非靶标生物的作用机理不一致所造成的。

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[3]蒋建科． 转基因水稻能不能放心吃[N].人民日报，2010-02-01.

[4]王 佳.200 亿元财政搅动转基因水稻商业“神经”[N].中国经营报，2010-01-17.

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[12]张 雁，郭同斌，诸葛强.转Bt 基因南林895 杨对杨扇舟蛾体内酶的影响[J].林业科学，2012，48（6）：95-99.