热休克蛋白27、70在老年性白内障晶状体上皮细胞中的表达

陈爽 赵清来

凡是由各种因素引起的晶状体混浊均称为白内障，是全世界致盲的主要原因，其中最常见的就是老年性白内障，年龄越大发病率越高，但它的发病机制尚不完全清楚。热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是一种进化上高度保守的细胞应激蛋白，可以保护机体在严酷的环境下得以生存。近年来，HSPs的表达与疾病的关系一直被人们所关注，其在晶状体上皮细胞中表达的特点也成为眼科界研究的一大热点。为探讨HSP27、HSP70在老年性白内障的形成中是否存在作用，我们利用免疫组化方法观察晶状体上皮细胞中HSP27、HSP70的表达特点，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 病例资料 随机收集2007～2010年本院住院确诊为老年性白内障行小切口白内障超乳手术患者102例，男性48例，女性54例，年龄53～88岁，平均(73.55±8.24)岁，其中皮质型36例，核型35例，后囊下型31例。病例均排除高度近视，葡萄膜炎，眼底病变等眼科其他疾病及糖尿病等影响晶状体代谢的全身性疾病。对照组取自健康尸体眼晶状体前囊膜5例，为青壮年。

1.2 晶状体前囊膜的采集及保存 撕取晶状体中央前囊膜，用生理盐水干净后，置于40 g/L多聚甲醛中固定，石蜡包埋，-25℃冰箱中保存备用。

1.3 HSP27、HSP70免疫组织化学观察

1.3.1 试剂 一抗：鼠抗人HSP27单克隆单体(1：100稀释)；鼠抗人HSP70单克隆单体(1：80稀释)；二抗：Envision试剂；DAB显色剂及Envision免疫组织化学试剂盒；PBS和TBS缓冲液。

1.3.2 实验步骤 取组织蜡块制成石蜡切块平铺于涂有APES的载玻片上，58℃烤24 h，二甲苯脱蜡，乙醇水化。PBS浸泡3 min×3次，3%H2O2室温孵育5～10 min。PBS浸泡3 min×3次，将切片置于0.01 molCB液中，98℃微波修复10 min，自然冷却至室温。PBS浸泡3 min×3次，加正常血清封闭，室温作用15 min。倾去多余水分，勿洗。加适量稀释的一抗，37℃水浴1～2 h。PBS浸泡3 min×3次，加 Envision试剂，37℃水浴10～15 min。PBS浸泡3 min×3次，DAB显色剂显色。自来水充分冲洗，苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.3.3 标本检测 用已知阳性标本作阳性对照，用PBS代替一抗，结果应为阴性。阳性为细胞核/浆着染为棕黄色或棕褐色，并呈颗粒状弥漫分布。每张切片随机观察5个视野，并记录阳性细胞率。阳性细胞率为5个视野内阳性细胞数占细胞总数的百分比。阳性细胞的分级标准为：-阴性；+阳性细胞＜5%；++阳性细胞5% ～25%；+++阳性细胞25% ～50%；++++阳性细胞50% ～75%；+++++阳性细胞＞75%。

1.4 统计学方法 采用SPSS 11.0软件，以秩和检验对数据进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

老年性白内障与正常晶状体上皮中均有HSP27、HSP70的表达，但各不相同。

HSP27在正常对照组晶状体上皮细胞中的表达为(28.40±4.05)%，而在老年性白内障晶状体上皮细胞中的表达：皮质型为(76.17±2.38)%，核型为(65.83±1.76)%，后囊下型为(57.71±2.15)%，三者与正常对照组相比均有显著性差异。且三者间差异也有统计学意义，即HSP27的表达皮质型组＞核型组＞后囊下型组。见表1。

表1 HSP27在晶状体上皮细胞中的表达(n)

HSP70在正常对照组晶状体上皮细胞中的表达为(29.60±4.95)%，而在老年性白内障晶状体上皮细胞中的表达：皮质型为(77.31±2.74)%，核型为(63.26±1.76)%，后囊下型为(57.23±2.23)%，三者与正常对照组相比均有显著性差异。且三者间差异也有统计学意义，即HSP70的表达皮质型组＞核型组＞后囊下型组。见表2。

表2 HSP70在晶状体上皮细胞中的表达(n)

3 讨论

所谓白内障是晶状体老化后的退行性变，是多种因素作用的结果。晶状体作为身体中蛋白质含量最高的器官，以重量计可高达湿重的35%，而晶状体的干重几乎全为蛋白质［1］。因此分析晶状体蛋白质的变化，是探讨白内障的形成机制的一大方向。

热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是生物体在不良环境因素作用下所产生的一组具有高度保守性的特殊蛋白，而且除了因热刺激而产生以外，还有很多因素，如重金属、缺氧、病毒或细菌感染等，都可以诱导其产生，因此也有人称之为应激蛋白［2］。它普遍存在于整个生物界，几乎所有的细胞均能合成HSPs，从而参与细胞的损伤与修复。Arrigo等［3］发现，衰老细胞中HSP27的表达量较高，它对过量自由基产生的蛋白氧化，脂质过氧化和DNA损伤都有抑制作用。Li等［4］发现，HSP70通过抑制线粒体细胞色素 C的释放及Caspase 3的活化来抑制细胞凋亡。在应激状态下，HSP27、HSP70的表达增加发挥了细胞保护，分子伴侣，信号传导，凋亡调节等作用，增强了细胞的耐受能力。

近年来的研究表明，晶状体能表达一系列的热休克蛋白，它们对维持晶状体的稳定和透明起到关键作用［5］。本实验采用免疫组织化学染色观察晶状体前囊膜上皮细胞中HSP27、HSP70的表达，发现老年性白内障中 HSP27、HSP70的含量均高于正常对照组，HSP27、HSP70的表达增加有利于阻止蛋白间不必要的相互作用，帮助变性蛋白重新折叠，维持了晶状体蛋白质的正确构象，从而延缓了白内障的发展。本实验通过比较皮质型、核型、后囊下型晶状体前囊膜上皮细胞中HSP27、HSP70的表达，还发现各型之间存在显著差异，其中皮质型HSP27、HSP70的表达＞核型＞后囊下型，故推测这三型白内障的发生机制可能不同，HSP27、HSP70蛋白在皮质型白内障发生机制中作用较强，而在后囊下型作用较弱，其具体作用机制有待进一步研究。

总之，我们可以从热休克蛋白具有抗氧化，分子伴侣，细胞保护等作用入手，探讨HSP27、HSP70在老年性白内障发生机制中的保护作用，为白内障的防治工作提供新视野。

［1］ 刘家琦，李凤鸣，吴静安，等．实用眼科学．第二版，北京：人民卫生出版社，2003：383-404.

［2］ Fuller KJ，Issels RD，Slosman DO，Guillet JG，Soussi T，Polla BS．Cancer and the heat shock response．EurJ Cancer，1994；30A(12)：1884-1891.

［3］ Arrigo AP，Ducasse C．Expression of the anti-apoptotic protein HSP27 during both the keratinocyte differentiation and dedifferentiation of HaCat cells：expression linked to changes in intracellular protein organization．Exp Gerontol，2002；37(10-11)：1247-1255.

［4］ Li CY，Lee JS，Ko YG．Heat shock protein 70 inhibits apoptosis downstream of cytochrome C release and upstream of Caspase 3 activation．J Biol Chem，2000；275(5)：25665-25671.

［5］ Berry Y．Alpha-B crystalline gene(CRYAB)mutation causes dominant congenital posterior polar cataract in human．Am J Hum Genet，2001；69：1141-1152．