甘蓝型油菜pol-CMS杂交种纯度SSR鉴定与田间鉴定单株吻合率研究

王同华，陈卫江，王建喜

（湖南省作物研究所，湖南 长沙410125）

利用杂种优势是提高油菜产量的重要途径。目前，我国的油菜杂种优势利用主要有细胞质雄性不育（CMS）、细胞核雄性不育（GMS）、自交不亲和（SI）和化学杀雄等途径[1]。其中，在我国目前生产应用中以波里马细胞质雄性不育（pol-CMS）杂种为主导类型。但该类型杂交种母本不育系育性存在温度敏感的特性[1-2]，即低温条件下易出现育性恢复现象，并以自交方式产生母本假杂种，严重影响杂交种的纯度。因此，对杂交种进行快速、准确的纯度鉴定，是确保油菜安全生产的重要保证。

目前，我国油菜种子纯度鉴定仍以传统的田间种植鉴定为主，该方法虽简单直观，但需要耗时近一个生长季节，不适合当前“北制南用”的杂交种生产需求。因此，快速、准确的种子纯度检测方法显得十分重要。随着分子生物学技术的发展，分子标记技术在研究中的应用越来越广。其中，SSR标记具有数量丰富、共显遗传、稳定性好[3-5]，且已经具备简单快速的分析方法[6-7]，在油菜种子纯度鉴定中已作为的首选标记得到广泛应用。但与其他作物一样，油菜SSR标记鉴定结果也存在与田间鉴定结果不吻合的现象[7-9]，而以往的报道多侧重样品结果的群体间对应研究，大多采用回归方程对结果进行校正，而对该两种鉴定方法间单株吻合率的研究报道甚少。研究以长江中游区推广面积较大的3个甘蓝型油菜pol-CMS杂交品种为对象，通过分析杂交制种样品SSR鉴定和田间鉴定的单株一一对应分析，更有效地探讨SSR标记技术在油菜杂交种纯度鉴定应用中的准确性，旨在为我国油菜杂交种的生产与销售提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为沣油737、丰油701、沣油520三个甘蓝型油菜pol-CMS杂交品种及其亲本相关信息见下表1，其中每品种取4份杂交制种样品，每份样品随即取400粒种子播种于湖南省作物研究所试验场。每份待测样品鉴定小区8行，行长2.0m，行距0.5m，均匀播种，全生育期不间苗。

表1 供试杂交油菜品种的父母本及审定情况

1.2 试验方法

1.2.1 样品DNA提取 在供试材料生长至9～11叶期时，从每个鉴定小区一端顺序数192个单株进行吊牌编号，并取中间幼嫩叶片2 cm2左右于2.0 mL离心管中，－20℃保存用于SSR标记检测。DNA提取参照王同华等[7]报道的简便方法进行。

1.2.2 SSR分析 试验所用112对SSR引物序列来源于http://uksrop.net，并由上海博尚生物技术有限公司合成。SSR-PCR反应体系参照陆光远等[6]报道的方法进行，PCR产物经3%的琼脂糖凝胶电泳分离，并用紫外成像系统进行观察读带。SSR纯度（%）=（检测株数－母本带型数－父本带型数）×100/检测株数。

1.2.3 田间鉴定 在供试材料发育至盛花期时，将上述192个吊牌编号的单株，根据育性表现进行调查，田间鉴定纯度（%）=（检测株数－不育株数－异型株数）×100/检测株数。

2 结果与分析

2.1 SSR引物筛选

研究利用112对SSR引物对供试3个杂交品种的父母本间进行PCR扩增，筛选到可将沣油737、丰油701、沣油520杂交种与母本区分开的引物分别为3、7、3个。根据带型清晰度、主带差异大小和稳定性，最终确定以SSR引物CB10373、Na10-D09、CN48分别作为沣油737、丰油701、沣油520的杂交种纯度鉴定引物（见图1）。其中引物CB10373在沣油737母本扩增出200 bp的片段，而在父本扩增出200 bp与220 bp的2个片段；引物Na10-D09在丰油701母、父本间分别扩增出250 bp、170 bp的片段；引物CN48在沣油520母、父本间分别扩增出170 bp、2 100 bp的片段。因此，该3个SSR引物可以用于3个供试杂交品种的纯度鉴定。

图1 三对SSR引物对供试品种父母本DNA的PCR扩增

2.2 SSR鉴定结果与田间鉴定结果的群体对比

利用筛选得到的SSR引物对供试材料进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶检测均得到清晰、稳定的条带（部分扩增结果见图2），可以确保SSR标记鉴定过程无读带偏差出现。从表2中可以看出，SSR标记鉴定和田间种植鉴定的结果高度一致，12个供试样品中有8个结果完全相同，其他4个样品的鉴定结果差异在2%以内，两种鉴定方法的平均偏差仅为0.35%，表明SSR标记鉴定结果与大田种植鉴定的结果是一致的。此外，对12个样品的鉴定数据进行分析，可以看出存在差异的4个样品的鉴定纯度均较差，在田间种植鉴定中主要表现为异型株，而在SSR标记鉴定中可能表现为父本或母本带型。

图2 引物CB10373对供试样品Y2的SSR-PCR扩增

2.3 SSR鉴定单株与田间鉴定单株结果吻合率分析

从田间种植鉴定和SSR标记鉴定结果对比分析结果（表2）中可以看出，12份供试样品的单株吻合率均在97%以上，其中有6个样品的吻合率为100%。其中，不吻合情况主要有可育株数检成母本带型、不育株检成杂交种带型、异型株数检成杂交种带型3种情况。对不吻合单株的表现进行分析，发现上述3种情况的出现呈随机状态，没有明显的规律性。造成两种鉴定结果不吻合的原因可能与农艺性状与分子标记间不关联、杂种亲本的纯合程度、制种田块自生苗类型以及制种环境的影响等因素有关，其确切原因需要进一步研究。

3 讨论

利用SSR标记鉴定甘蓝型油菜杂交种具有简便、快速、不受环境因素影响、鉴定结果稳定性好等优点，目前在油菜杂交种纯度鉴定中已广泛应用[5，10]。以往关于SSR标记在作物种子纯度鉴定的准确性研究主要集中在与田间种植鉴定纯度结果的群体间对应上，研究者通常利用SSR标记和田间种植鉴定结果对比，建立回归方程以校正两种方法的鉴定误差。笔者认为这种做法存在着一定的局限性：首先，种植鉴定受土壤、肥力和气候等条件影响，弱苗和不能成苗的种子得不到准确观测值，而室内SSR标记鉴定可对这部分种子作出准确判断，得到样品的原始纯度；其次，种植鉴定与室内SSR标记鉴定是对同一样品的不同次抽样鉴定，抽样误差也可导致鉴定结果出现偏差。另外，种植鉴定主要根据品种形态特征和生物学性状进行判定，受检测人员经验水平和样品亲本的遗传差异度影响较大，也是造成结果差异的重要原因。鉴于此，研究以甘蓝型油菜杂交种样品同一抽样样品田间单株为研究对象，通过SSR标记和田间种植鉴定的一一对比分析，结果表明该两种方法鉴定结果具有高度的一致性，证明利用SSR标记鉴定甘蓝型油菜杂交种的纯度是准确可靠的。

表2 田间种植鉴定和SSR标记鉴定的纯度结果

表3 供试样品的田间种植鉴定和SSR标记鉴定单株吻合率结果

对于研究中出现的极少数不吻合单株，笔者认为主要有3个方面的原因：一方面为制种田或鉴定田自生苗的干扰，表现为SSR母本带型单株育性表现却正常；另一方面，制种环境隔离不当导致无恢复基因外源花粉漂入，可能造成SSR杂种带型单株却表现为不育；此外，来自收获、晾晒、运输和包装过程的机械混杂，在SSR鉴定中可能表现为父母本或杂交种带型，也是造成鉴定结果不吻合的因素。因此，在实际生产应用中要综合考虑制种环境、管理措施的影响，根据需要对两种鉴定方法综合应用，以确保鉴定结果的准确性。

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