虫螨腈在稻田环境及水稻中的残留分析方法

2013-09-24杨仁斌

湖南农业科学 2013年7期

任珂，杨仁斌，傅强

（湖南农业大学农业环保研究所，湖南长沙410128）

虫螨腈（Chlorfenapyr）又名除尽、溴虫腈，是一种新型取代芳基吡咯类杀虫、杀螨剂[1]。主要通过作用于昆虫体内多功能氧化酶（MFO）来抑制线粒体ADP向ATP转化，由于其作用机理新颖，杀虫谱广、对常规农药无交互抗性，近年来广泛应用于防止水稻、棉花、蔬菜、柑桔、葡萄、大豆等作物的多种害虫和害螨[2]。然而，研究表明虫螨腈对人、鸟、鱼、蚕低毒，同时对小鼠的肝、脾、肾细胞DNA会产生损伤[3]。因此，许多国家对虫螨腈的残留限量都进行了严格的规定，如美国国家环保署规定溴虫腈在各种蔬菜、水果上的最大允许残留量为1 mg/kg，日本规定在大豆、青花菜、小松菜、四季豆、大葱、胡萝卜等蔬菜产品上的MRL分别为0.05、3.0、3.0、0.05、3.0、0.1 mg/kg[4]。目前国内有关虫螨腈在土壤、蔬菜、烟叶等农产品中的残留分析方法已有不少研究，主要采用气相色谱法（GC）和气相色谱-负化学电离质谱法（GC-NCIMS）等[5-10]。气相色谱法需要萃取和过柱2次净化，操作步骤繁琐；气相色谱-负化学电离质谱法虽然准确度和灵敏度高，但仪器价格昂贵。试验采用高效液相色谱法对稻田环境及水稻中虫螨腈的残留进行分析，旨在为高效液相色谱法在虫螨腈残留检测中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

岛津-LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司，带紫外检测器和工作站），KYC-1102C型恒温双层培养摇床（上海福玛实验设备有限公司），RE-2000型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），DLSB-5L/25型低温水循环泵（巩义市予华仪器厂），SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），FW80高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器厂），KQ-100E超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）等。

虫螨腈标准品（纯度98.61%，农药检定所）、甲醇（色谱纯），丙酮、二氯甲烷、乙腈、氯化钠、无水硫酸钠、中性氧化铝（均为分析纯）、活性炭等。

1.2 试验设计

1.2.1 样品制备稻田水样采用定性快速滤纸过滤；稻田土样送回实验室后去掉植物残体、砂石，将样品混匀，采用四分法缩分样品，取出其中的1/4装入样品袋中，贮存在－20℃的冰箱中；水稻稻株剪碎成1 cm以下小段，混匀；再粉碎稻米和稻壳，分别将处理的稻株、稻米和稻壳样品装入样品袋，放入－20℃冰箱中贮存，备用。

1.2.2 样品提取水样：准确量取100 mL待测水样于250 mL分液漏斗中，依次用50、40、30 mL二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷相经无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发仪上（45℃）浓缩至近干。

土样：准确称取待测土样20 g于250mL的具塞三角瓶中，用40 mL乙腈超声提取15 min，转入已加有5～8 g Nacl固体的100 mL具塞量筒中，剧烈振摇1 min后静置分层，用移液管移出上层有机相20 mL于250 mL具塞三角瓶中，旋转蒸发仪上（45℃）浓缩至近干。

水稻稻株、稻米、稻壳：称取稻株、稻米、稻壳样品10 g，于250 mL的具塞三角瓶中，稻株样品用80 mL丙酮超声提取15 min（稻米和稻壳用80 mL甲醇提取），经过布氏漏斗减压抽滤，用20 mL丙酮（甲醇）分3次洗涤残渣和抽滤瓶，合并抽滤液入250 mL具塞三角瓶中，旋转蒸发仪上（45℃）浓缩至近干。

1.2.3 样品净化稻田水样、土样、稻米样品：样品较干净（无需净化），直接用5 mL色谱甲醇定容，待测。

稻株和稻壳样品：在2 g中性氧化铝+0.5 g活性炭的层析柱中，先用20 mL二氯甲烷和甲醇（体积比7∶3）混合溶液预淋，再用60 mL二氯甲烷和甲醇（体积比7∶3）混合溶液转移浓缩提取液，收集。于旋转蒸发仪上（45℃）浓缩近干，再用5.0 mL色谱甲醇定容，待测。

1.2.4 高效液相色谱检测条件色谱柱为Inertsil ODS-SP色谱柱，5μm，250 mm×4.6 mm（i.d.）；流动相为甲醇-水（体积比83∶17）；流速1.0 mL/min；柱温30℃；紫外检测波长260 nm；进样量20μL；在上述色谱条件下，虫螨腈的相对保留时间为8.280 min；外标法定量。

1.2.5 加标回收试验依据国外制定的虫螨腈在水稻上的最大残留限量，设置了0.1、1.0、5.0 mg/kg 3个添加水平，进行空白样品加标回收试验。分别量取100 mL水、称取20 g土壤、10 g稻株、稻米、稻壳空白样品，设置5组平行处理，加入一定量的虫螨腈标准溶液，使空白样品中虫螨腈的质量浓度为0.1、1.0、5.0 mg/kg，按上述方法进行提取、净化和液相色谱检测。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件优化

2.1.1 样品提取溶剂的选择添加1 mg/L的虫螨腈标样到稻株、稻米和稻壳中，分别加入乙腈、甲醇、丙酮80mL超声15min进行比较。结果表明：在水稻稻株中用乙腈和甲醇为提取剂其回收率为40.07%～53.69%；若在稻米中，选用乙腈和丙酮提取，空白有较大峰，回收率偏低且有杂质峰干扰；在稻壳中选用丙酮其回收率为44.29%，均不符合要求，用乙腈做提取剂样品中有杂质干扰，回收率偏高（见表1）。因此选择丙酮提取稻株中的虫螨腈，甲醇提取稻壳和稻米中的虫螨腈。

表1 不同提取剂对水稻稻株、稻米、稻壳中虫螨腈回收率的影响

2.1.2 样品提取方法的确定振荡1 h和超声15 min提取方法的比较结果表明，无论低浓度还是高浓度加标试样，2种提取方法回收率都能达80%以上。相比振荡提取，该方法缩短了提取时间，节约了能源。

2.2 样品净化方法的筛选

2.2.1 层析柱的确定稻株和稻壳样品用丙酮和甲醇超声提取后，色素深，杂质多，不能直接测定，故需要进一步净化，分别选取中性氧化铝-活性炭和弗罗里硅土作为吸附剂。从净化结果来看，两者去色素效果均较好，都可应用于样品净化。但弗罗里硅土柱农药峰受杂质干扰。因此，试验选择中性氧化铝-活性炭为吸附剂。

2.2.2 淋洗剂的确定由于虫螨腈易溶于丙酮、乙腈和醇类，根据化学溶剂的极性强弱，配置石油醚∶乙酸乙酯、二氯甲烷∶乙酸乙酯、甲醇∶乙酸乙酯三种淋洗剂。但通过虫螨腈与稻株和稻壳中的分离情况，最终确定选用甲醇∶乙酸乙酯。再进行柱淋洗试验，通过测定加标回收率（见表2），确定最佳的淋洗剂组成为甲醇∶二氯甲烷=30∶70。

表2 柱层析净化中不同淋洗剂对稻株和稻壳中虫螨腈回收率的影响

2.2.3 淋洗液用量确定淋洗曲线（图1）表明，采用0.10 mg/L添加水平时所需的体积为60 mL。

图1 虫螨腈淋洗曲线

2.3 标准曲线与色谱图

图2 虫螨腈标准色谱图

虫螨腈标准色谱峰见图2，其相对保留时间为8.280 min。在1.2.4仪器检测条件下，虫螨腈峰面积与进样质量在1～40 ng范围内线性关系良好，线性回归方程为：y=37 284 x+303.79，相关系数为：R2=0.9999。

2.4 方法灵敏度

在上述色谱条件下，虫螨腈的最低检出质量为1.0×10-9g（S/N=3），通过最低浓度添加试验得到样品在稻田水、土、稻株、稻米、稻壳中的最低检出浓度分别为0.005、0.05、0.1、0.1、0.5、0.01mg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

在空白样品中的加标回收试验结果见表3。由表3可知：方法的准确度和精密度均符合国家农药行业标准—《农药残留实验准则（NY/T788-2004）》的要求，能够用于实际样品的残留检测分析。

表3 虫螨腈在水稻及稻田环境中的方法回收率

2.5.1 稻田水中虫螨腈加标回收用50、40、30 mL二氯甲烷萃取3次，能去除杂质。虫螨腈在稻田水样中的平均加标回收率为93.56%～96.77%，标准差为1.43～2.76，变异系数为1.48%～2.95%。空白水样和加标1mg/kg虫螨腈样品色谱峰见图3、图4。

2.5.2 稻田土壤中虫螨腈加标回收适量的乙腈能很好的从土壤中提取出虫螨腈，经过固液萃取，可省去繁琐的过柱操作。虫螨腈在稻田土样中的平均加标回收率为93.22%～99.96%，标准差为1.42～2.79，变异系数为1.52%～2.79%。空白土样和加标1 mg/kg虫螨腈样品色谱峰见图5、图6。

图3 水样空白色谱图

图4 水样添加虫螨腈色谱图

图5 土样空白色谱图

图6 土样添加虫螨腈色谱图

2.5.3 稻田稻株中虫螨腈加标回收适量的丙酮能有效的提取水稻稻株中的虫螨腈，且经中性氧化铝-活性炭过柱后，不影响虫螨腈的检测。虫螨腈在水稻稻株中的平均加标回收率为103.21%～109.22%，标准差为1.88～3.35，变异系数为1.82%～4.41%。空白土样和加标1mg/kg虫螨腈样品色谱峰见图7、图8。