几种香料植物提取物对大肠杆菌抑制作用的试验

李利红，陈忠杰，卢婷婷，解克伟

（1．郑州牧业工程高等专科学校药物工程系，河南 郑州450011；2．禹州森源本草天然产物有限公司，河南 禹州461683）

致病性大肠杆菌病是现代规模化、集约化畜禽养殖的主要传染病之一，目前尚无理想的疫苗来预防，临床主要采用抗菌药物治疗。近年来，由于抗菌药物的持续和不恰当地使用，大肠杆菌耐药机制不断变迁，耐药性不断提高［1－3］，导致抗菌药物的疗效降低甚至失去疗效；大肠杆菌耐药现象已经成为现代畜牧业健康养殖的限制性瓶颈，而抗菌药物不规范使用所带来的的环境卫生和食品安全问题也已越来越受世人关注，因此如何选用对大肠杆菌有较好抑制作用的药物是当今兽医临床的主要任务之一。中草药具有来源广、副作用小、不易产生耐药性等特点，已经成为现代预防和控制细菌性感染疾病方面的重要研究对象［4－5］。近年来关于中药芳香性物质的抗微生物活性报道很多［6－8］，但是关于其对大肠杆菌抑制效果的研究报道不多，因此，本试验选取丁香、八角茴香和迷迭香3种香料植物，提取其中的5种主要成分，在体外研究其对大肠杆菌的抑制作用，期望为兽医临床合理使用中草药提取物防治大肠杆菌病提供理论和试验依据，为研究和开发抗菌中药解决耐药菌株的产生和抗生素短缺问题提供途径。

1 材料与方法

1．1 材料与仪器

1．1．1 试验材料 迷迭香采自河南禹州森源本草天然产物有限公司种植基地，其他药材购自郑州零售药店。

所用菌株分别为：大肠杆菌（标准型）；大肠杆菌（临床致病型，从犊牛稀粪便中分离）。菌株由郑州牧业工程专科学校药物工程系实验室提供。

1．1．2 主要仪器与试剂 CTXNW－2B循环超声萃取仪（北京弘祥隆生物技术开发有限公司）；R－1001－VN旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；RE－5210旋转蒸发仪（上海亚荣）；LXJ－IIB离心机（上海安亭科学仪器厂）；P230II高效液相色谱仪（上海依利特）；BT125D十万分之一分析天平（赛多利斯），阿贝折射仪（上海宇隆2W）。

鼠尾草酸和迷迭香酸标准品，均由禹州森源本草天然产物有限公司提供；重蒸水，甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。

1．2 方法

1．2．1 精油的提取制备 称取丁香、八角茴香和迷迭香药材各500g，用水蒸气蒸馏法提取各自的挥发油，20℃以下测定相对密度和折光率。

1．2．2 迷迭香酸和鼠尾草酸的提取制备 称取提取过精油的迷迭香残渣200g，用40倍体积的90%乙醇进行回流提取1h（加少许柠檬酸），将提取液进行过滤，滤液和残渣分别用来提取鼠尾草酸和迷迭香酸。滤液进行减压浓缩至1／5体积，4 000r／min离心，保留沉淀物，进行真空干燥，称重，用HPLC测定鼠尾草酸含量。残渣加50倍体积的水进行超声提取30min，过滤，对滤液进行减压浓缩和真空干燥，称重，用HPLC测定迷迭香酸含量。

1．2．3 迷迭香酸和鼠尾草酸含量的测定 （1）鼠尾草酸标准品溶液的配制：精密称取105℃干燥4h后至质量恒定的鼠尾草酸标准品10．0mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度定容，摇匀，其质量浓度为1mg／mL作为标准溶液；（2）迷迭香酸标准品溶液的配制：精密称取80℃下干燥至恒重的迷迭香酸标准品10．0mg溶于10mL甲醇溶解并稀释至刻度定容，得1mg／mL迷迭香酸标准溶液；（3）鼠尾草酸样品测定：称取鼠尾草酸提取物100mg，无水乙醇定溶至50mL，微孔滤膜过滤，超声脱气，HPLC测定。采用C18柱，流动相为乙腈：0．1%磷酸＝60∶40，流速为1mL／min，230 nm测定；（4）迷迭香酸样品测定：称取迷迭香酸提取物100mg，甲醇定溶至50mL，微孔滤膜过滤，超声脱气，HPLC测定。采用C18柱，流动相为甲醇∶0．05%磷酸＝45∶50，流速为0．6mL／min，283nm测定。均做平行试验3次，以峰面积按外标法进行定量计算。

1．2．4 菌种的复壮与扩增 参照文献［9］进行大肠杆菌的复壮和扩增，用于营养琼脂平板涂菌。

1．2．5 涂菌 取制备好的营养琼脂平板培养基，分别加入100μL制备好的105CFU／mL菌液，用涂菌玻璃棒涂均匀。

1．2．6 打孔 用直径为6．5mm的打孔器在涂菌的琼脂培养基上均匀打孔，并编号，每种药重复两个平皿，每个平皿做3个孔。孔径大小、深度保持均匀一致。打好孔后在酒精灯火焰上略微加热，使局部培养基熔化重新凝固与平皿底部结合，防止加入的药物从底部的缝隙流出。

1．2．7 加药 将迷迭香酸和鼠尾草酸配制成含有效成分1mg／mL的水溶液，挥发油直接添加，分别加入各孔中，每孔加20μL药液，置于恒温箱中37℃条件下，培养24h。取出，量取抑菌圈直径。每孔在不同方向测量2次，取平均值。

1．2．8 抑菌结果判定 抑菌效果判定，抑菌直径＞20mm为极敏感，用“＋＋＋＋”表示；15～19mm为高敏感，用“＋＋＋”表示；10～14为中敏感，用“＋＋”表示；10mm以下为低敏感，用“＋”表示；“－－”表示无抑菌作用。

2 结果与分析

2．1 提取结果 迷迭香经蒸馏、脱水后得到无色透明迷迭香油，提取率为1．5%（平均每100g原料得到1．5mL 精油），相对密度为0．869，折光率为1．466。丁香花蕾经蒸馏、脱水后得到无色透明丁香油，提取率为9．5%（平均每100g原料得到9．5mL精油），相对密度为1．041，折光率为1．532。八角茴香经蒸馏、脱水后得到无色透明八角茴香油，提取率为5．3%（平均每100g原料得到5．3mL精油），相对密度为0．982，折光率为1．555。鼠尾草酸的提取率为7%；迷迭香酸的提取率为4%。

2．2 迷迭香酸和鼠尾草酸含量测定结果 230nm下，经HPLC测定，鼠尾草酸的纯度为16．24%；迷迭香酸的纯度为5．37%。

2．3 药物敏感性测定结果 几种提取物的抑菌圈测定结果见表1所示。

表1 抑菌圈测定

由表1可见，鼠尾草酸和迷迭香酸都对致病性大肠杆菌表现高度敏感，对标准型大肠杆菌表现中度敏感；迷迭香油和丁香油对标准型大肠杆菌的抑制作用均明显大于对致病性大肠杆菌的抑制作用；八角茴香油对两种大肠杆菌的抑制作用相差不明显。几种提取物对标准型大肠杆菌的抑菌效果依次为：丁香油＞鼠尾草酸＞迷迭香油＞迷迭香酸＞八角茴香油，最大抑菌圈达20mm；对临床型大肠杆菌的抑菌效果依次为：鼠尾草酸＞迷迭香酸＞八角茴香油＞迷迭香油＞丁香油，最大抑菌圈达19 mm。

3 讨论

3．1 本试验用现代中药提取、分析技术，对几种中药提取物抑制大肠杆菌的作用进行了体外试验，具有工艺稳定、有效成分含量明确、质量可控的特点；本试验表明，迷迭香酸、鼠尾草酸、迷迭香油、丁香油和八角茴香油均有较强的体外抑制大肠杆菌作用。

3．2 由于中药成分复杂，抗感染疗效主要以增加机体免疫力为途径，因此目前中药抑菌作用的研究方面还存在试验操作缺乏统一标准、体内体外试验结果不一致和作用机制探讨不深等问题［10－12］。今后应进一步借助现代先进的工艺和分析方法，加强对中药抗感染药物的正确认识，深入探讨中药作为抗感染治疗和消除细菌耐药性的作用途径和作用效果。

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