解酯假丝酵母脂肪酶的性质及固定化

张 健, 郑 来 久, 薛 永 常

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

脂肪酶(EC3.1.1.3,Lipase)是一种水解酶,能够在油-水界面上催化酯水解、酯合成、酯交换及立体异构体拆分等化学反应[1],存在于动物、植物及许多微生物中,目前已被广泛应用于皮革、皮毛、绢纺、食品、医药等行业[2]。

我国工业化生产解酯假丝酵母脂肪酶已有几十年的历史。徐岩等[3]曾对其酶学性质进行了研究,但由于产酶菌种的不同,酶学性质也会发生很大的变化。作者以解酯假丝酵母为出发菌种,对其发酵产生的脂肪酶粗酶进行了性质研究,同时对其固定化进行了初步探索。

1 实 验

1.1 材 料

解酯假丝酵母(Candidalipolytica),本实验室保藏；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 脂肪酶粗酶液的制备

将新鲜的解酯假丝酵母种子接到发酵培养基中,28 ℃、160 r/min条件下摇床培养30 h,将发酵所得的发酵液在4 ℃、10 000 r/min下离心15 min,取上清液即为所需脂肪酶粗酶液[4]。

1.2.2 脂肪酶水解活力的测定

脂肪酶活力的测定采用碱滴定法[5]。酶活定义:在40 ℃、pH 7.5条件下,每分钟水解产生1 μmol脂肪酸的酶量定义为一个脂肪酶单位。

1.2.3 酶的最适温度与最适pH测定

最适温度:将脂肪酶的游离酶和固定化酶分别放到不同的温度下,测定其各自的酶活力(pH控制为7.5)。

最适pH:在40 ℃下,改变磷酸缓冲液的pH,在不同的pH条件下测定脂肪酶游离酶和固定化酶的酶活。

1.2.4 硅藻土固定化酶的制备

将制备的脂肪酶粗酶液进行盐析,冷冻干燥,加到相应的缓冲液中,搅拌充分溶解,然后将定量硅藻土加入到酶液中,恒温搅拌一段时间后离心收集固体,冷冻干燥即为所制得的固定化酶。

2 结果与讨论

2.1 解酯假丝酵母产脂肪酶粗酶液的酶学性质

2.1.1 酶的最适反应温度

测定了30～55 ℃该脂肪酶粗酶液的酶活,以最高酶活为100%绘制相对酶活曲线。从图1可以看出,温度对脂肪酶粗酶液的酶活影响较大,在40 ℃时表现出最高酶活力,当温度再升高5 ℃时,酶活迅速降低,其相对酶活只有30%左右,说明酶液的热稳定性较差。

图1 脂肪酶的最适反应温度

2.1.2 酶的最适反应pH

测定了pH 5.0～8.5该脂肪酶粗酶液的酶活,以最高酶活为100%绘制相对酶活曲线。从图2可看出，当pH达到7.5时,脂肪酶的酶活最大。由此可见,该脂肪酶的最适反应pH为7.5。

图2 脂肪酶的最适反应pH

2.1.3 酶的热稳定性研究

将粗酶液在40、50、60 ℃水浴中分别保温100 min,每隔20 min测一次酶活。由图3可见,粗酶液在40 ℃下保温20 min后,没有明显失活。40 ℃保温100 min,仍能保留60%左右的酶活；在50 ℃下,100 min后可以保留约30%的酶活；在60 ℃情况下,粗酶液的酶活迅速下降,60 min后,酶活只有20%左右,在100 min后酶活为0。

图3 脂肪酶的热稳定性

2.1.4 酶的pH稳定性研究

取酶液与不同pH (5.0～9.0)的缓冲液以1∶5比例混合,在4 ℃保育48 h,再将酶液pH调回到7.5,按标准酶活法测定残留酶活力,结果如图4所示。该酶在pH 6.0～8.0活力损失较小,在其他pH范围内酶活损失较大。

图4 脂肪酶的pH稳定性

2.2 脂肪酶的固定化条件

2.2.1 给酶量对酶固定化的影响

在脂肪酶的固定化过程中,加入的酶量对固定化酶活性影响较大。在最适固定化作用时间、温度和pH下考察了载体与酶量的比例对酶固定化的影响。图5表明,随着硅藻土用量的相对增加,固定化酶的催化活力逐渐升高,当硅藻土超过一定量时,单位固定化酶催化活力降低。当载体与脂肪酶的质量之比为14时,固定化脂肪酶催化活力最高。

2.2.2 温度对酶固定化的影响

在脂肪酶的固定化过程中,温度会影响酶的活性,在脂肪酶固定化时合适温度很重要。在最适pH为8.0下,按一定比例将载体与脂肪酶溶液混合,在20～45 ℃对脂肪酶进行固定化,时间为2 h。图6表明随着温度的升高,固定化脂肪酶的催化活力逐渐增加,当温度大于30 ℃时,随着温度的升高,酶的催化活力反而降低。因此本实验中脂肪酶的最适固定化温度为30 ℃。

图5 载体与酶量的比例对酶固定化的影响

Fig.5 Effect of the ratio of diatomite to lipase on immobilized lipase

图6 温度对固定化效果的影响

2.2.3 缓冲液pH对酶固定化的影响

在脂肪酶的固定化过程中,缓冲液的pH可改变酶和载体的离子化状态,是影响其催化活力和载体吸附酶分子的重要因素[6]。图7表明,利用硅藻土在偏碱性的条件下(7.5

图7 缓冲液pH对酶固定化的影响

2.2.4 时间对固定化酶的影响

在最佳条件下,采用不同的固定化时间,制得固定化酶的酶活力如图8所示。在起始阶段,随着固定化时间的延长,酶活逐渐升高,当固定化时间大于2 h,酶活开始下降。

图8 时间对固定化酶的影响

3 结 论

解酯假丝酵母发酵产脂肪酶粗酶液的最适作用温度为40 ℃,最适pH为7.5,pH 6.0～8.0酶活损失较少,在40 ℃保存100 min后仍能保留60%左右的酶活；在50 ℃下,100 min后可以保留约30%的酶活；在60 ℃情况下,100 min后酶活为0。

利用硅藻土吸附法对脂肪酶进行固定化,固定化的最佳条件为:载体与脂肪酶质量比为14,固定化温度为30 ℃,缓冲液pH为8.0,固定化时间为2 h。

[1] 王智,高仁钧,杨硕,等. 有机相中脂肪酶催化拆分环氧丙醇的研究[J]. 吉林大学自然科学学报, 2001(1):81-84.

[2] 宋欣. 微生物酶转化技术[M]. 北京:化学工业出版社, 2004:123.

[3] 徐岩,李建波,王栋. 解脂假丝酵母脂肪酶的纯化及性质研究[J]. 无锡轻工大学学报, 2001, 20(3):257-260.

[4] 王丽丽,高忠涛,杜冰,等. 基于响应面法优化生物酶洗毛工艺[J]. 毛纺科技, 2010, 38(7):9-14.

[5] PERALTA J M, RUBIOLO A C, ZORRILLA S E. Design and construction of a hydrofluidization system. Study of the heat transfer on a stationary sphere[J]. Journal of Food Engineering, 2009, 90(3):358-364.

[6] 高贵,韩四平,王智,等. 硅藻土固定化脂肪酶[J]. 吉林大学学报:理学版, 2002(3):324-326.