自发性高血压大鼠心室重构及脂联素受体1的表达

林书坡 周更苏(邢台市人民医院心内科，河北 邢台 054000)

脂联素(APN)具有改善胰岛素抵抗、抗动脉粥样硬化、抗炎等作用。APN主要通过与其靶器官和组织上相应受体结合而发挥其病理生理作用。近来研究发现，APN与高血压所致的心室重构有密切关系，APN可能对心室重构有抑制作用〔1〕。Yamauchi等〔2〕于2003年首次克隆出人类和小鼠脂联素受体。APN主要有两种受体:脂联素受体1(AdipoR1)和脂联素受体2(AdipoR2)。心肌组织主要表达AdipoR1〔3〕。目前，关于心肌组织AdipoR1与高血压所致心室重构研究较少。因此，本研究拟通过对SHR大鼠心室重构情况和心肌AdipoR1及其mRNA表达水平的变化研究，旨在探讨AdipoR1在高血压所致心室重构中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁级12周龄雄性自发性高血压大鼠(SHR)为实验组，相同周龄的雄性京都Wistar大鼠(WKY)为对照组，每组8只。体重(271±30)g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号为SCXK(京)2007-0001。自由饮食，每两周测一次血压和体重，12 w后进行超声心动图检查及取材测定各指标。

1.2 主要的试剂与仪器 兔抗大鼠AdipoR1多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)、β-actin小鼠抗大鼠单克隆抗体(美国Cell Signaling公司)、Trizol Reagent(美国 Invitrogen Life Technologies公司)、RT-PCR试剂盒和 DNA Marker(大连 TaKaRa公司)、PCR引物(北京华大基因公司合成)、凯基全蛋白提取试剂盒(南京凯基生化有限公司)、硝酸纤维素膜(Millopore公司)、羟脯氨酸测定试剂盒和Masson染色试剂盒(南京建成生物公司)、Philips iE33型彩色多普勒超声仪(Philips公司)、PCR扩增仪(德国Biometra)。

1.3 大鼠收缩压的测量 应用尾套式小动物血压测量计测定大鼠血压，步骤如下:固定大鼠尾部，于白炽灯下照射加热约10 min，使大鼠尾部血管扩张后将尾部套于压敏传感器上。在大鼠清醒、安静的状态下，应用生物信号采集处理系统直接同步记录尾动脉压力和脉搏曲线，当出现第1个脉搏波时向尾套气囊内充气，逐渐阻断大鼠尾动脉血流直至脉搏波完全消失，然后放气至第1个脉搏波重新出现，此波所对应的压力值即为收缩压。

1.4 超声心动图评价大鼠左心室结构和功能 腹腔注射3%戊巴比妥钠35 mg/kg麻醉大鼠后，胸部备皮，仰卧位固定，略向左侧倾斜，将探头置于大鼠胸部正中位或略偏左对大鼠进行超声检查，取得满意的胸骨旁左心室长轴二维图像后，M型超声心动图测定左心室舒张末期内径(LVEDD)、舒张末期室间隔厚度(IVST)及左室后壁厚度(LVPWT)。调整脉冲多普勒扫描速度，将取样容积放在二尖瓣与左室流出道之间描记多普勒血流频谱图，测定二尖瓣口舒张早期和舒张晚期血流E峰、A峰峰值流速，计算E/A比值。

1.5 左心室重量指数(LVWI)的测量及心肌标本的采集 采血后迅速取出心脏，生理盐水冲洗残血，滤纸吸干，去除大血管残根和结缔组织，沿房室交界处剪去心房，沿室间隔剪去右心室，保留室间隔和左心室，称左心室重量。LVWI=左心室重量(mg)/体重(g)。切取部分左室游离壁心肌，4%多聚甲醛中固定备用。其余心肌置液氮罐中冷冻后，－70℃冰箱保存备用。

1.6 心肌形态学观察 心肌形态学观察心肌组织HE染色，观察组织病理形态学变化。Masson染色，光镜下观察并拍片，用图像分析系统测定并计算心肌胶原容积分数(CVF)。CVF=心肌胶原面积/所测视野面积，所有标本均随机取4个视野测量，取平均值。

1.7 羟脯氨酸(Hyp)含量测定 取冻存心肌100 mg，脱水，脱脂，将沉淀烘干并研成粉末。取20 mg干粉，加入6 mmol/L HCl 3 ml，放入试管中于95℃水浴20 min，冷却后用6 mmol/L NaOH调pH值至6.0，加水至10 ml，3 500 r/min离心10 min。过滤取上清液，按照Hyp检测试剂盒的要求检测，计算Hyp含量。

1.8 RT-PCR方法检测心肌组织AdipoR1 mRNA表达 Trizol一步法提取总RNA，利用紫外分光光度计测定并计算总RNA浓度和纯度，将总RNA浓度经DEPC处理的双蒸水调整至1 μg/μl，按照RT-PCR试剂盒说明，用 AMV逆转录酶将 RNA逆转录为cDNA。设计并合成大鼠AdipoR1引物，上游引物序列:5'-ATCCGCAGGTCAACG-3'，下游引物序列:5'-GGAGGAGGGCATAGGT-3'，PCR扩增片段长度526 bp。选用β-actin为内参照，上游引物序列5'-GCCAACCGTGAAAAGATG-3'，下游引物序列5'-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3'，PCR扩增片段长度701 bp。扩增条件为 94℃ 5 min，98℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72℃ 1 min，共30个循环，72℃ 10 min。取10 μl扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像系统上显影照相，用凝胶成像分析软件分析，计算AdipoR1 mRNA的相对表达量。AdipoR1 mRNA表达量的相对值=AdipoR1基因扩增条带的灰度值/β-actin基因扩增条带的灰度值。

1.9 Western印迹方法检测心肌AdipoR1蛋白的表达 取冻存心肌组织100 mg匀浆器匀浆，凯基全蛋白提取试剂盒提取心肌组织总蛋白质，Bradford法蛋白定量，取标本蛋白50 μl上样，经10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶(10%SDSPAGE)电泳分离蛋白，转移至硝酸纤维素膜，5%去脂奶粉的TTBS封闭4℃过夜。TBS洗膜5 min×3次，加入1∶400稀释的AdipoR1兔抗大鼠多克隆抗体、β-actin小鼠抗大鼠单克隆抗体，室温下2 h。清洗:TTBS洗5 min×2次，TBS洗5 min×1次。酶显法显色剂显色。扫描，凝胶成像分析系统成像，测定各条带灰度值，记录结果。计算各蛋白带灰度值/内参β-actin蛋白灰度值的比值。

2 结果

2.1 收缩压变化 SHR组大鼠收缩压随周龄的增长而逐渐升高，而WKY组收缩压无显著变化。两组收缩压在同一时期均具有显著差异(P＜0.01)。见图1。SHR大鼠具有收缩压持续升高的特点，是研究高血压的理想动物模型。

2.2 超声心动图各指标的比较 与WKY组相比，SHR组IVST和LVPWT均增加，LVEDD和E/A值降均低，具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。各组大鼠左室壁及室腔各切面显示较清晰。提示SHR大鼠心室肥厚和左室舒张功能有所降低。

2.3 LVWI的比较 SHR组大鼠LVWI明显升高，与WKY组比较差异显著(P＜0.05)。见表2。

2.4 心肌形态学的改变 WKY组大鼠心肌细胞大小及染色未见异常，排列规整;SHR组大鼠心肌纤维体积增大，染色相对不均匀，排列紊乱，心肌纤维，心肌间质成纤维细胞肥大增生。见图2。

2.5 心肌组织Masson染色及CVF的比较 Masson染色下心肌细胞呈红色，胶原呈蓝色。WKY组大鼠心肌间质可见少量胶原，主要位于血管周围。SHR组大鼠心肌组织中胶原明显增多，呈栅栏状排列紧裹心肌细胞。见图3。SHR组CVF显著高于WKY组(P＜0.05)。见表2。

2.6 心肌组织Hyp含量的比较 SHR组Hyp含量显著高于WKY组(P＜0.05)。Hyp含量可反映心肌胶原含量，结果提示SHR大鼠心肌胶原增多。见表2。

表1 各大鼠超声心动图指标比较(n=8，±s)

表1 各大鼠超声心动图指标比较(n=8，±s)

与WKY组比较:1)P＜0.05

组别 IVST(mm)LVPWT(mm)LVEDD(mm)E/A WKY组1.37±0.17 1.28±0.08 6.19±0.34 1.90±0.05 SHR组 1.67±0.191)1.53±0.161)5.24±0.211)1.52±0.111)

图1 各组大鼠收缩压水平的变化

图2 心肌形态学改变(HE，×400)

图3 心肌Masson染色(×400)

表2 各组LVWI、CVF、Hyp含量比较(n=8，±s)

表2 各组LVWI、CVF、Hyp含量比较(n=8，±s)

与WKY组比较:1)P＜0.05

组别 LVWI(mg/g) CVF(%) Hyp(μg/g)WKY组2.59±0.09 3.17±0.31 326.4±37.5 SHR组 2.93±0.121) 6.25±0.291) 523.8±65.31)

2.7 心肌AdipoR1 mRNA表达的比较 SHR组心肌组织AdipoR1 mRNA表达(0.39±0.03)显著低于 WKY组(0.78±0.06)，具有统计学意义(P＜0.05)。见图4。

图4 RT-PCR分析AdipoR1 mRNA在心肌的表达

2.8 心肌AdipoR1蛋白表达的比较 与WKY组(0.73±0.26)相比，SHR组(0.37±0.03)心肌组织 AdipoR1蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)。见图5。

图5 Western印迹方法分析心肌组织AdipoR1蛋白表达

3 讨论

APN是由Scherer等〔3〕于1995年在小鼠脂肪细胞中发现一种新的蛋白质。脂联素主要在脂肪细胞表达，现已发现机体多种组织均有表达。以往研究显示，脂联素具有调节糖脂代谢、改善胰岛素抵抗、抗动脉粥样硬化、抗炎等作用。APN以内分泌方式循环于血液中，通过与其靶器官和组织上相应受体结合而发挥其病理生理作用。

2003 年，Yamauchi等〔2〕首次克隆出人类和小鼠脂联素受体，并发现有2种APN受体:AdipoR1和AdipoR2。人和鼠AdipoR1基因有96.8%的同源性。AdipoR1主要表达在骨骼肌细胞，对APN的球状结构域具有高亲和力，但对全长APN亲和力低。而AdipoR2主要表达在肝细胞，对两者具有中等亲和力。此外，内皮细胞、单核细胞、胰岛β细胞、巨噬细胞和受损血管内皮细胞等均有APN受体的表达。有研究证明，AdipoR1和AdipoR2也存在于心肌细胞，其中以AdipoR1为主〔4〕。APN受体包含7个跨膜结构域，但它们的N端在细胞内，C端在细胞外，这与G蛋白偶联受体的结构相反，因此APN受体可能不与G蛋白偶联发挥作用，而直接激活下游一些信号分子如过氧化物酶体增殖物激活受体 α(PPARα)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和p38丝裂原活化蛋白激酶而发挥作用。

最近越来越多的研究发现，APN与高血压发生密切相关。Matsubara等〔5〕研究表明，血浆APN的浓度在高血压患者低于正常人群。Kubota等〔6〕发现APN敲除(KO)小鼠在动脉受机械损伤后内膜增生比野生小鼠严重，而感染携带有APN基因的腺病毒之后却能完全扭转动脉内膜的过度增生，证明脂联素是内生的血管保护者。越来越多的研究支持APN作为一种保护因子参与高血压的发生。APN可能是通过调节血管结构和功能以及调节血脂等作用而对高血压产生间接作用。

关于APN与高血压靶器官损害方面的研究较少。Mitsuhashi等〔1〕研究发现低脂联素是左室肥厚的独立危险因素。Shibata等〔7〕研究也表明，在APN基因敲除小鼠，用压力负荷方式极易诱导出心肌肥厚，增加死亡率。而将腺病毒携带的APN基因重新转入体内后可以逆转这种趋势。Huang等〔8〕最新研究发现，APN和AdipoR1在体外培养的大鼠成纤维细胞高度表达，APN对成纤维细胞增生有抑制作用。目前APN在高血压心肌重构中作用机制尚不清楚。可能机制为高血压时压力负荷增加、交感神经兴奋等因素导致儿茶酚胺增多和RASS激活，这些神经体液因子可以作用于脂肪细胞以及其他能分泌APN的组织细胞，使得脂联素分泌减少，同时，下调心肌细胞膜上AdipoR1表达，从而使磷酸腺苷激活的蛋白激酶磷酸化激活减少〔7〕，使心肌能量代谢发生障碍及其对蛋白合成抑制作用减弱，导致高压力负荷状态下心室重构的发生。目前，关于这一机制的研究较少。本研究发现24周龄SHR有心室重构发生，SHR大鼠发生了左室心肌肥厚。另外，Hyp是机体胶原蛋白特有的一种氨基酸，除弹性蛋白含有少量羟脯氨酸(1%)外，几乎所有Hyp都存在于胶原蛋白中。本研究提示心肌间质发生一定程度的纤维化，心肌AdipoR1表达的下调可能与高血压心室重构有关。至于APN与AdipoR1结合后是通过AMPK信号通路还是其他的信号通路，或者各通路共同作用而在高血压心室重构发挥作用，尚不清楚，还有待更深入的研究。

随着人们对APN及其受体在高血压以及高血压心室重构发病机制中研究的不断深入，人们将会逐渐认清其作用机制，AdipoR1激动剂有可能成为临床新药研发和高血压及高血压靶器官损害治疗的新思路。

1 Mitsuhashi H，Yatsuya H，Tamakoshi K，et al.Adiponectin level and left ventricular hypertrophy in Japanese men〔J〕.Hypertension，2007;49(6):1448-54.

2 Yamauchi T，Kamon J，Ito Y，et al.Cloning of adiponectin receptors that mediate antidiabetic metabolic effects〔J〕.Nature，2003;423(6941):726-9.

3 Scherer PE，Williams S，Fogliano M，et al.A novel serum protein similar to Clq，produced exclusively in adipocytes〔J〕.J Biol Chem，1995;270(45):26746-9.

4 Fujioka D，Kawabata K，Saito Y，et al.Role of adiponectin receptors in endothelin-induced cellular hypertrophy in cultured cardiomyocytes and their expression in infarcted heart〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006;290(6):2409-16.

5 Matsubara M，Maruoka S，Katayose S.Inverse relationship between plasma adiponectin and leptin concentrations in normal-weight and obese women〔J〕.Eur J Endocrinol，2002;147(2):173-80.

6 Kubota N，Terauchi Y，Yamauchi T，et al.Disruption of adiponectin causes insulin resistance and neointimal formation〔J〕.J Biol Chem，2002;277(29):25863-6.

7 Shibata R，Ouchi N，Ito M，et al.Adiponectin-mediated modulation of hypertrophic signals in the heart〔J〕.Nat Med，2004;10(12):1384-9.

8 Huang D，Yang C，Wang Y，et al.PARP-1 suppresses adiponectin expression through poly(ADP-ribosyl)action of PPAR gamma in cardiac fibroblasts〔J〕.Cardiovasc Res，2009;81(1):98-107.