苜蓿多糖在畜禽饲料中的应用

陈元元 朱宇旌 张 勇

(沈阳农业大学畜牧兽医学院，沈阳 110866)

紫花苜蓿是世界上栽培面积最广的豆科牧草之一，具有抗寒、抗旱、耐瘠薄、抗风沙等特点。苜蓿干物质含量可达10% ～15%，粗蛋白质、维生素和矿物质含量丰富，氨基酸平衡。苜蓿多糖(alfalfa polysaccharides，APS)是从紫花苜蓿中提取的具有生物活性的植物多糖，是苜蓿的重要营养成分，无毒性，可提高畜禽免疫功能，应用于畜禽饲料可避免抗生素带来的耐药性及药物残留等问题，具有很好的经济效益和社会效益，因此，将APS开发为饲料添加剂应用于畜禽饲料具有重要意义。

1 APS的结构

APS是由酸溶性碳水化合物构成的酸性多糖，成分为葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸和另一种未知单糖，不含蛋白质和淀粉。超滤法测得其分子质量为 20 ～60 ku[1]。

2 APS的提取

APS为水溶性非淀粉多糖，难溶于乙醇，性质稳定，主要提取方法有醇提法和水煮法，考虑到操作简单和节约试剂成本，多选用水煮法提取。试验得出APS的最佳提取条件为:温度100℃，料水比1∶40 ～1∶20，浸提时间 1 ～2 h，醇析时乙醇浓度为80% ～95%[2]，具体条件受苜蓿品种、茬次和试验条件等因素影响。超声波辅助可使温度降低到70～80℃，浸提时间缩短到20～30 min，并可提高提取率[3]。

3 APS的纯化与纯度鉴定

水煮法得到的APS含较多杂质，其中蛋白质成分居多，实验室中最常用的多糖脱蛋白质方法是savage法，最常用的多糖分级与纯化采用Sephadex凝胶柱层析法。Sephadex是一种葡萄糖凝胶，A系列Sephadex利用不同多糖分子与其吸附程度不同的原理，对样品进行分级和纯化。G系列Sephadex依据各种多糖分子质量的不同而将其分开。APS分离出AP1、AP2、AP3和AP4 4个组分，其中AP2和AP3是主要成分，二者都为均一多糖。AP2-a和AP3-b 2种组分纯度较高，不含蛋白质、多肽、核酸、糖醛酸、淀粉等杂质，不含还原糖、单糖和二糖，它们的物理性质均为白色粉末，易溶于热水，较难溶于冷水，不溶于乙醇、乙醚、丙酮、正丁醇等有机溶剂，黏度较大，气味清香，平均分子质量分别为15 019和20 739 u，活性范围在10 000～2 000 000 U，均属活性多糖。AP2-a中含有D-吡喃葡萄糖、D-果糖及吡喃环结构，AP3-b中含有D-吡喃葡萄糖、D-果糖和D-鼠李糖及吡喃环结构，其中D-吡喃葡萄糖是与免疫、抗氧化和抗肿瘤等生物活性相关的结构。

4 APS的生物学功能

4.1 APS的免疫调节功能

植物多糖具有广泛的生物活性，普遍具有免疫调节作用[4-5]。免疫器官的发育状况可直接影响机体免疫应答水平、抵抗外来微生物感染和侵入的能力[6]。试验证明，APS能不同程度地促进畜禽免疫器官胸腺、法氏囊、脾脏、盲肠、扁桃体的发育，延缓胸腺的萎缩[7]，还能促进肉鸡肠道后段有益菌的生长，特别是乳酸菌，抑制埃希大肠杆菌的增殖，增强机体的抵抗力[8]。APS还能促进淋巴细胞增殖转化，增强细胞免疫功能[9]。在体外APS能够刺激植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)和PWM培养液诱导的淋巴细胞增殖反应，说明APS有缩短细胞周期、显著提高T细胞转化率的作用，它还能增强由T细胞介导的细胞免疫能力，对自然杀伤细胞(NK)的活化有影响[10]。另有试验证明，红细胞通过其表面的C3b受体与抗原-抗体-补体免疫复合物(CIC)结合而发挥清除CIC和促进吞噬的作用，增加红细胞免疫功能，说明APS对鸡红细胞免疫功能具有继发增强作用。APS还能纠正环磷酰胺对抗体形成细胞的抑制作用，在增强机体防御能力的同时快速消灭病原体，清除机体内的衰老死亡细胞[11]。研究表明，APS可能通过抗原递呈细胞(APCs)对抗恶性细胞或恶性细胞碎片，抗原肽在APCs上结合到主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ或Ⅱ，MHCⅠ分子的抗原肽激活早期细胞毒性T细胞(CD8+)，而MHCⅡ分子的抗原肽激活早期辅助性T细胞(CD4+)，T辅助细胞1(Th1)产生细胞因子，包括白介素2(IL-2)和干扰素 γ(IFN-γ)，这些细胞因子诱导细胞增殖和肿瘤抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)的激活，激活NK和巨噬细胞，诱导淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)产生(图1)[12]，所以 APS 可显著促进CD4+增殖和提高CD4+/CD8+，进而起到免疫作用。APS还可提高机体的体液免疫功能，调节B细胞、CTL和M细胞等细胞功能，促进免疫球蛋白(Ig)类抗体含量的提高，促进IL-2的产生和白介素2受体(IL-2R)的基因表达，诱导白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子 α(TNF-α)的产生[13]。APS通过增强机体的免疫力，减少应激，把与病变相关的无效免疫应答降到最低限度，从而使营养成分被充分利用，这可能是APS改善动物生长性能的机制之一[14]。

4.2 APS的抗氧化功能

机体的代谢产生过多自由基会引起病变甚至死亡，但自身防护系统对自由基的清除能力有限[15]，现被广泛应用的合成抗氧化剂因其毒性而减少使用，植物多糖作为一种天然抗氧化生物活性化合物而备受关注。APS作为一种自由基清除剂，除了与其化学结构有关，它还可以通过激活内源性抗氧化防御系统起到间接保护的作用，可能有2种作用机制:第一，APS可能与自由基直接反应来提高抗氧化酶活性;第二，APS可能会影响抗氧化酶的基因表达，并调节特定酶的活动[16]。1，1-二苯基 -2-苦基苯肼(1，1-dipheyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)和羟自由基是2个最有代表性的自由基。DPPH是一种稳定的自由基，抗氧化剂将电子或氢原子转移到DPPH，从而消除了DPPH的自由基性质，抗氧化剂的抗氧化活性可通过对DPPH的抑制率表示，通过测试DPPH可以反映出自由基的清除程度。羟自由基是破坏性最强的自由基，它能通过所有需氧有机体形成和分解[17]，会导致任何主要生物分子(如DNA、蛋白质、脂类和小细胞)的氧化损伤，进而导致心血管和神经性疾病[18]。自由基生成引起老化是因为活性氧族(reactive oxygen species，ROS)的增加和抗氧化防御的降低，前者主要是生物体正常细胞代谢的副产品，多产生于线粒体。ROS能引起脂质过氧化、氨基酸残基氧化、蛋白质交联形成DNA氧化损伤。正常生理条件下，ROS可以保护细胞的系统清除，但在某些病理条件下，ROS之间生成和消除动态平衡可能被打破，导致细胞ROS水平增加，高水平的ROS可能在各种细胞成分中发生氧化损伤，并导致细胞死亡[19]。正常的生物体内都有其抗氧化防御的清除氧化剂，来防止ROS对细胞的损伤。如超氧化物歧化酶(SOD)是一种在线粒体中含有的，对活性氧进行有效防御的酶，它能通过超氧阴离子自由基加速过氧化氢的形成，清除氧自由基。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)可将过氧化氢和过氧化物分解为无毒的产品，并通过细胞膜脂质过氧化物终止脂质过氧化的链式反应。SOD和GSH-Px的内源性抗氧化酶可以将ROS转化成更少的有毒化合物，超氧化物先由SOD分解成过氧化氢，随后通过一系列包括GSH-Px的活性酶催化和转化变成水。丙二醛(MDA)可通过监测机体内脂质过氧化代谢产物反映自由基对组织细胞的损伤[20]。这些抗氧化酶能由脂质过氧化物或自由基引起失活，从而导致其在氧化条件下通过各种条件诱导的毒性激活，ROS产量是评价活细胞的氧化损伤程度的直接指标。研究表明，APS能清除ROS同时抑制自由基的产生[21]，还能够提高SOD、GSH-Px活性，减少MDA的生成，进而提高机体抗氧化能力[22-24]，保护机体正常细胞免受自由基攻击，说明APS对机体有显著的抗氧化作用，这也是它抗衰老、抗炎症、降血脂、抗肿瘤等功效的药理基础[25]。在一定浓度下，APS清除DPPH及羟自由基的作用，随浓度的增加而增强，存在剂量-效应关系[26]，但因淋巴细胞中存在对多糖的反馈调节机制，所以并非其浓度越高抗氧化作用越好。另外，不同植物多糖的抗氧化效果不同，可能与其化学结构和组成有关[27]。

图1 苜蓿多糖的免疫应答和作用方式流程图Fig.1 Schematic representation of immune responses and actions of APS[12]

4.3 APS的抗肿瘤功能

恶性肿瘤已成为威胁人类生存的主要疾病之一，多糖可进行免疫调节，且无毒副作用。研究表明，多糖抗肿瘤的机制是通过刺激相关细胞发生免疫反应，强化或活化相关免疫细胞，提高TNF-α、超氧化物离子和IL-2等细胞因子含量。多糖抗肿瘤是通过提高机体的特异性或非特异性免疫功能，增强寄主自身的免疫力而发挥作用的。由相关试验可知，APS抗肿瘤可能有3个主要作用机制(图2):第一，通过抑制增加癌症的免疫因子的产生或中和免疫因子提高宿主免疫力。第二，直接或通过调节各种细胞因子的产生来激活免疫细胞。第三，直接作用于癌细胞，诱导细胞凋亡，MHCⅠ抗原的表达增强。这些机制是现已发现的多糖抑制癌症复发的理论依据。张东杰等[28]的试验说明APS在一定程度上抑制了荷瘤小鼠体重的增加，延长了其生存期，对肿瘤的治疗有帮助。

4.4 APS的抗感染功能

机体的宿主细胞抗菌防御系统遭到破坏时可能被细菌感染，另外细菌也能通过在宿主上皮黏膜表面定植来感染健康细胞。许多细菌可与宿主细胞表面的糖类结合，称为黏附。细菌主要以长丝状菌毛结构黏附宿主细胞，菌毛从细菌细胞表面呈辐射状，许多细菌毒素也由单个蛋白质亚基聚集而成，每个亚基包含1个或多个糖类结合位点(图3)。与细菌结构相似的糖类可通过竞争与宿主细胞结合而抑制细菌定植或黏膜上皮细胞中毒[29]。一般单个糖序列与蛋白质结合能力很低，通过每个蛋白质与糖的结合点组成多聚体，可使糖类与蛋白质的结合能力显著增加，这样一种蛋白质便可与同源寡聚多糖紧密结合。多糖抗感染就是通过多糖与宿主细胞蛋白质结合，从而使细菌失去与宿主细胞结合的亲和力，无法结合宿主细胞受体上的糖序列而抑制细菌感染的。

图2 肿瘤微环境和苜蓿多糖的作用过程Fig.2 Tumor microenvironment and actions of APS[12]

图3 细菌与宿主细胞表面结合Fig.3 The binding of microbes to cell surfaces of the host[29]

4.5 APS的其他功能

APS在一定剂量范围内对畜禽有明显的促进生长、增强免疫功能、抗氧化、抗感染的作用，对T细胞、B细胞活化有免疫增强作用，APS还有降血脂、降血糖、降血压、解毒、抗血栓、镇痛、消炎、抗菌、抗辐射、抗疲劳、抗衰老、抗虫、化感等作用[30]，另外APS还可治疗高胆固醇，强化血管和预防动脉硬化、心肌梗塞等。

5 APS在畜禽饲料中的应用

5.1 APS在肉鸡上的应用

APS可以提高畜禽抗病能力。郝永清等[10]用APS做肉仔鸡疫苗佐剂进行试验，结果显示肉仔鸡体内抗体免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)水平提高，说明多糖可通过激活补体强化抗体作用，增强畜禽免疫功能，提高畜禽抗病能力。

APS可以促进畜禽生长。夏素银等[31]用肉仔鸡进行试验，分别在基础饲粮中添加0、0.5%、1.0%和2.0%APS，结果显示添加APS 1%组增重高于0组，而2%组低于0组，1%组效果最好。说明添加APS能够促进畜禽生长但存在剂量效应，适量添加APS可提高畜禽对饲粮的利用率，促进蛋白质合成;江振莹等[32]试验肉仔鸡不同生长阶段的体重测定结果显示，APS可以促进畜禽生长，其中1%添加组效果最好。

APS可以促进畜禽免疫器官的发育。郝永清等[33]分别将APS通过不同途径对肉仔鸡进行试验，结果显示APS可促进肉仔鸡胸腺、法氏囊、脾脏、盲肠和扁桃体发育，说明APS能够促进畜禽免疫器官的发育。

APS可以促进畜禽淋巴细胞的增殖和转化。刘晴雪等[34]分别将不同浓度的APS加入体外培养肉仔鸡淋巴细胞，测定其增殖变化，结果显示淋巴细胞的吸光度值(OD)随APS浓度增加先增高后降低;同浓度APS对不同器官淋巴细胞刺激程度不同，外周血和脾脏淋巴细胞OD低于胸腺和法氏囊;APS对外周血、脾脏、法氏囊和胸腺的最佳刺激浓度分别为 20、8、15 和 15 μg/mL。说明APS可通过刺激淋巴细胞的增殖提高畜禽的抗病能力。江振莹等[32]分别添加0、1% 、8%APS 对肉仔鸡进行试验，结果显示APS能使鸡血清中鸡新城疫抗体滴度提高，促进细胞吞噬和转化能力，8%添加组效果最好。郝永清等[33]将APS分别用肌注(2.5、5 和 10 mg/只)、加入疫苗(2.5、5 和10 mg/只)、饲料添加剂(0、10和80 mg/kg)3种不同方式对肉仔鸡进行试验，在不同生长阶段检测外周血淋巴细胞的增殖，结果显示APS可促进肉仔鸡淋巴细胞转化率和细胞吞噬功能，提高血清中鸡新城疫的抗体滴度。APS肌注5 mg/只组与配伍疫苗10 mg/只组和8%饲粮中添加组促进免疫器官发育效果最好。说明APS能增强畜禽的细胞免疫功能，提高畜禽抗病能力。章世元等[35]分别用15、20和50 μg/mL APS对肉仔鸡进行试验，结果显示适量APS可提高T细胞OD，促进肉仔鸡淋巴细胞增殖，20 μg/mL时效果最好，说明APS可促进畜禽淋巴细胞增殖，且存在剂量效应(表 1)。

表1 APS在肉鸡上的应用效果Table1 Application effects of APS on broilers

5.2 APS在仔猪上的应用

张世军等[36]将APS加入猪瘟兔化弱毒疫苗对仔猪进行免疫和攻毒试验，结果显示试验组仔猪外周血液的B细胞含量和IgG水平提高，仔猪发热比对照组晚，时间短，程度轻，对猪瘟强毒抵抗力增强，比单一疫苗预防猪瘟效果好。说明APS可强化猪瘟疫苗免疫作用，且不会损害肝、心脏等脏器。

6 小结

我国苜蓿资源丰富，APS的原料成本相对较低，无毒副作用，容易实现产业化，因此倍受国内外市场青睐。APS具有增强免疫力、抗氧化、抗感染、抗肿瘤、降血脂、降血糖、解毒、抗菌、抗炎等作用，作为一种植物提取物，在一定剂量范围内增强畜禽免疫力，降低疾病死亡率，促进动物生长，有利于提高动物繁殖与机体性能，现已在畜禽养殖中大量应用。近年来随着人们对食品安全、动物营养等各个领域重视度的不断提高，APS在相关领域的作用日益凸显。随着多糖制备、结构、合成研究的不断深入，其应用市场将更加广阔。但是苜蓿产品产业化仍然存在一定问题:产业化投资需求大;市场对产品的数量要求大;科研投入不足等。另外APS分离提纯的程序复杂，质量标准不好控制，结构测定也尚无一种有效方法，因此APS在畜禽饲料中的应用还有待进一步研究与探索。

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