鱼诺卡氏菌全肽聚糖对乌鳢非特异性免疫力的影响

彭程远 解 俊 金 珊 赵青松 陈寅儿 王国良

(宁波大学海洋学院，宁波 315211)

诺卡氏菌(Nocardia)是一种革兰氏阳性丝状杆菌，属于放线菌类微生物，它是水产动物诺卡氏菌病的主要致病菌，可引起五条 (Seriola quinqueradiata)、海鲈(Lateolabrax japonicus)、大黄鱼(Pseudosciaena crocea)、乌鳢(Channa argus)等多种养殖鱼类的严重死亡［1］。鱼类诺卡氏菌病由于发生延续流行时间长，从感染至死亡的时间一般需15 d以上，且早期体表无明显症状，因此至今还没有很好的技术手段来预防和治疗该病［2］。

肽聚糖(peptidoglycan，PG)是细菌细胞壁的重要组成部分，是一种强免疫增强剂，主要通过诱导各种免疫调控物质的释放或表达来刺激机体免疫系统发挥免疫功能［3］。全肽聚糖(whole peptidoglycan，WPG)是指未经物理破碎并保持细菌细胞壁骨架“袋形”结构完整性的肽聚糖［4］。研究表明，WPG是一种生物反应调节剂，它在动物体内体外都能激活免疫细胞、活化补体并调节机体的体液免疫和细胞免疫应答，表现出较强的免疫赋活作用，且其免疫活性与其细胞壁物理形态的完整程度呈正相关［5-7］。

鱼类非特异性免疫机制主要包括细胞防御和体液防御，其细胞防御主要是通过各种血细胞的吞噬作用来实现的，而体液防御因子分布于血清、黏液及组织细胞中，主要有溶菌酶等多种酶、补体、干扰素、凝集素等，它们能非特异性地抑制多种微生物的生长［8-9］。为了明确WPG对鱼类非特异性免疫力的调节作用，本试验根据鱼类的免疫特点［9］和其他学者的研究资料［10-16］筛选出了与鱼类非特异性免疫相关的检测指标，研究了 鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)WPG对乌鳢黏液、血清及肝脏、肾脏组织中主要非特异性免疫指标的影响，以期为鱼类诺卡氏菌病免疫防治寻找新的契机，为诺卡氏菌亚单位疫苗的研制及免疫增强剂的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验动物与饲养管理

试验用乌鳢购自宁波市水产市场，体重300～400 g，共250尾，养于室内大水族箱中，并用遮阳布适当遮盖。根据水质情况每天及时吸出粪便并用事先曝气处理的自来水换水1～2次，每次换水1/3，试验期间连续充氧，每天投喂鱼体重5%的小杂鱼，早晚各1次。

1.3 样品的制备

将100尾乌鳢分为试验组和对照组，每组5个重复，每个重复10尾。试验组每尾腹腔注射0.3 mL质量分数为1%的 鱼诺卡氏菌WPG溶液，对照组同法等量注射0.7%灭菌生理盐水。于腹腔注射后第 0、1、2、3、4、5、6、7、8 天随机从各重复中取5尾鱼进行样品的采集。首先采集鱼体表黏液，参照陈昌福等［17］的方法进行;然后用注射器尾静脉采血，所采血液分为2份，一份不抗凝，取出后直接放入离心管中4℃静置2 h后，4℃离心(3 000 r/min)10 min，取上层血清冷藏待测，另一份用无菌肝素钠抗凝，用于血细胞吞噬指数(phagocytic index，PI)的测定;最后无菌操作解剖鱼取肝脏和头肾组织，冷藏待测。

1.4 样品的处理

1.4.1 黏液的处理［18］

将收集有黏液的Eppendorf管于4℃下3 000 r/min离心，用移液枪枪头吸掉管底的重力水，称重记录数据，扣除空Eppendorf管管重(取20个管的均值)后得黏液净重，按所得黏液净重加入9倍重量的灭菌生理盐水，冰浴匀浆后于4℃离心(10 000 r/min)15 min，取上清液分装，冷藏待测。

1.4.2 组织的处理

分别取肝脏和头肾，经灭菌生理盐水润洗，吸水纸吸去表面水分后称重，取各组织块0.2 g，加入9倍重量的灭菌生理盐水，后续操作同1.4.1。

1.5 血细胞吞噬指数的测定

取0.3 mL抗凝血，等量加入酵母菌悬液(6.0×108cell/mL)，边加边摇，28℃放置45 min，每隔10 min左右摇1次，取出后1 500 r/min离心5 min。弃去上清液后取表层细胞制成血涂片，自然干燥后甲醇固定5 min，吉姆萨(Giemsa)染色15～20 min，风干后油镜下随机观察50个参与吞噬的细胞，记录吞噬细胞内酵母菌总数，计算吞噬指数。

1.6 血清替代途径补体活力(alternative complement pathway activity，ACH50)的测定

ACH50的测定参照Yano［18］的方法进行。先将保存在阿氏液(Alsever’s solution)中的兔红血细胞用缓冲液EGTA-Mg2+-GVB缓冲液冲洗3遍后，用该缓冲液将其浓度调至2.0×108cell/mL，再将待测血清也用上述缓冲液稀释20倍备用。取7支离心管，其中1～6号离心管分别加入0、0.050、0.090、0.125、0.150、0.250 mL EGTA-Mg2+-GVB缓冲液，并加入事先稀释好的血清，使每支离心管中总体积为0.250 mL;7号离心管为100%溶血对照管，仅加入3.400 mL蒸馏水。同时向每一离心管中加入0.100 mL浓度为2.0×108cell/mL的兔红血细胞，20℃温育90 min，期间不断摇动，反应结束后立即将所有离心管放入冰浴中终止反应，然后向1～6号离心管中加入3.15 mL的生理盐水。所有离心管在1 600×g下离心5 min，取上清液在414 nm下测定吸光度(OD)值，以未加血清的6号离心管作为空白对照。样品的溶血度由相应的OD值除以100%溶血对照管的OD值求出Y，以Y/(1-Y)为横坐标，以对应的血清体积X(mL)为纵坐标作图，将产生50%溶血时的血清体积记为K。

血清ACH50(unit/mL)=1/K×血清稀释倍数。

1.7 酶活力及蛋白质含量的测定

血清、黏液、肝脏及头肾组织中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶(LSZ)活力及蛋白质含量的测定均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行。

1.8 鱼诺卡氏菌WPG对乌鳢的攻毒保护试验

将150尾乌鳢分为免疫组和对照组，每组75尾。免疫组每尾腹腔注射0.3 mL质量分数为1%的 鱼诺卡氏菌WPG溶液，对照组同法等量注射0.7%灭菌生理盐水。在免疫后的第7、21、35天，分别从免疫组和对照组各取20尾鱼用浓度约为3.0×108CFU/mL的 鱼诺卡氏菌菌悬液腹腔注射0.2 mL/尾进行攻毒试验，逐日观察记录乌鳢45 d内的死亡情况并计算免疫保护率。

1.9 数据统计分析

试验结果以平均值±标准差表示，采用SPSS 16.0软件进行统计分析。以t检验进行差异显著性检验:P＞0.05，不存在显著差异;P＜0.05，存在显著差异;P＜0.01，存在极显著差异。

2 结果与分析

2.1 鱼诺卡氏菌WPG对乌鳢血细胞吞噬指数的影响

乌鳢红细胞和白细胞都具有吞噬异物的功能，它们对酵母菌的吞噬作用分别见图1和图2。注射 鱼诺卡氏菌WPG后乌鳢血细胞吞噬指数的变化见表1。与对照组相比，试验组乌鳢红细胞和白细胞吞噬指数均在注射后第1天就显著或极显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，在第2天达峰值，随后红细胞和白细胞吞噬指数均逐渐下降，在注射后第3天、第4天红细胞吞噬指数仍显著或极显著高于对照组(P＜0.05或P＜0.01)。

图1 红细胞对酵母菌的吞噬作用Fig.1 Phagocytosis of erythrocytes on yeast(1 000×)

图2 白细胞对酵母菌的吞噬作用Fig.2 Phagocytosis of leukocytes on yeast(1 000×)

2.2 鱼诺卡氏菌WPG对乌鳢血清ACH50的影响

2.3 鱼诺卡氏菌WPG对乌鳢不同组织中ACP活力的影响

表1 注射 鱼诺卡氏菌WPG后乌鳢血细胞吞噬指数的变化Table 1 The variation of haemocytes phagocytic index of Channa argus after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) %

表2 注射 鱼诺卡氏菌WPG后乌鳢血清ACH50的变化Table 2 The variation of serum ACH50 of Channa argus after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) unit/mL

表3 注射鱼诺卡氏菌WPG后乌鳢不同组织中ACP活力的变化Table 3 The variation of ACP activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) U/dL

表3 注射鱼诺卡氏菌WPG后乌鳢不同组织中ACP活力的变化Table 3 The variation of ACP activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) U/dL

时间点Time points组织Head kidney第0天 试验组 Experimental group 21.79±2.90 55.20±5.20 398.02±15.53 427.42±20.55 Day 0 对照组 Control group 22.10±2.57 53.41±5.33 399.35±3.20 428.50±27.68第1天 试验组 Experimental group 28.95±1.90＊＊ 74.87±12.80＊＊ 517.15±19.05＊＊ 510.44±8.71＊＊Day 1 对照组 Control group 20.91±2.69 52.24±3.49 405.52±10.24 431.27±15.51第2天 试验组Experimental group 24.69±0.89* 87.52±4.24＊＊ 415.56±24.28 464.62±28.03*Day 2 对照组 Control group 22.29±2.83 51.72±5.36 401.67±6.68 434.96±20.01第3天 试验组 Experimental group 26.66±2.23* 60.14±8.65 406.21±10.57 514.13±26.94*Day 3 对照组 Control group 22.63±2.40 55.58±8.37 401.42±14.10 446.20±9.38第4天 试验组Experimental group 40.92±1.33＊＊ 57.60±4.48 598.76±28.41＊＊ 474.74±18.50*Day 4 对照组 Control group 21.41±2.30 50.12±2.21 399.91±16.70 422.45±25.24第5天 试验组Experimental group 30.63±1.74＊＊ 58.27±6.02 402.31±12.66 452.47±11.36 Day 5 对照组 Control group 20.89±1.02 50.47±3.29 390.23±30.95 437.47±10.67第6天 试验组Experimental group 32.08±2.31＊＊ 52.19±5.56 443.30±31.52* 504.53±15.32＊＊Day 6 对照组 Control group 21.75±1.96 49.55±7.40 400.89±15.37 433.22±19.84第7天 试验组 Experimental group 31.14±2.39* 57.03±1.78 424.07±15.84 541.66±22.56＊＊Day 7 对照组 Control group 22.09±2.44 51.08±5.93 401.54±20.52 425.73±16.71第8天 试验组 Experimental group 31.81±2.92* 58.27±5.12 404.76±22.90 487.25±33.15*Day 8 对照组 Control group 22.31±3.36 51.68±9.01 391.00±16.64 437.97±3.50组别Groups Tissues血清Serum 黏液Mucus 肝脏Liver 头肾

表4 注射鱼诺卡氏菌WPG后乌鳢不同组织中AKP活力的变化Table 4 The variation of AKP activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) 金氏单位/dL

表4 注射鱼诺卡氏菌WPG后乌鳢不同组织中AKP活力的变化Table 4 The variation of AKP activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) 金氏单位/dL

时间点Time points组织Head kidney第0天 试验组 Experimental group 7.10±1.35 51.67±2.54 205组别Groups Tissues血清Serum 黏液Mucus 肝脏Liver 头肾.44±8.67 468.36±28.56 Day 0 对照组 Control group 7.00±2.52 52.43±1.21 203.17±8.25 469.64±27.02第1天 试验组 Experimental group 7.99±1.96 50.78±6.92 209.63±16.86 490.15±26.49 Day 1 对照组 Control group 6.67±1.12 48.47±6.68 206.05±10.22 462.79±20.06第2天 试验组 Experimental group 8.53±2.12 47.84±2.75 210.08±29.05 468.23±24.95 Day 2 对照组 Control group 7.28±2.81 46.31±4.63 204.73±19.67 462.08±28.81第3天 试验组 Experimental group 8.10±1.30 47.47±8.17 241.81±25.80* 474.54±25.43 Day 3 对照组 Control group 7.72±0.97 50.27±11.03 202.42±11.42 464.97±26.95第4天 试验组Experimental group 9.33±0.98* 56.23±2.80 264.13±24.73＊＊ 471.25±26.01 Day 4 对照组 Control group 7.95±1.82 53.68±1.61 200.52±21.77 474.90±23.72第5天 试验组 Experimental group 8.12±1.24* 50.24±3.71 203.03±11.85 478.49±26.84 Day 5 对照组 Control group 7.56±0.75 48.83±3.05 200.97±13.69 475.43±27.33第6天 试验组Experimental group 16.16±1.98＊＊ 49.22±12.62 219.39±21.31 469.52±24.65 Day 6 对照组 Control group 8.45±1.19 51.27±9.22 198.50±23.74 469.16±18.27第7天 试验组 Experimental group 9.60±0.41* 50.31±3.72 205.38±15.26 475.21±22.11 Day 7 对照组 Control group 8.15±1.12 46.23±11.32 191.18±28.60 475.08±22.22第8天 试验组 Experimental group 9.51±0.32 48.95±7.88 192.43±20.60 480.79±7.53 Day 8 对照组 Control group 8.90±1.72 50.32±6.66 191.27±16.55 468.65±26.52

表5 注射鱼诺卡氏菌WPG后乌鳢不同组织中SOD活力的变化Table 5 The variation of SOD activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) U/mL

表5 注射鱼诺卡氏菌WPG后乌鳢不同组织中SOD活力的变化Table 5 The variation of SOD activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) U/mL

时间点Time points组织Head kidney第0天 试验组 Experimental group 108.82±17.65 20.18±3.48组别Groups Tissues血清Serum 黏液Mucus 肝脏Liver 头肾13.26±1.52 6.42±1.45 Day 0 对照组 Control group 107.96±17.66 20.76±1.20 13.56±1.64 6.38±0.80第1天 试验组 Experimental group 136.53±14.45* 23.33±2.79* 14.81±1.90 7.39±1.29 Day 1 对照组 Control group 103.00±10.62 20.17±2.03 14.13±1.42 7.15±1.00第2天 试验组Experimental group 152.35±6.37＊＊ 28.91±1.28＊＊ 13.93±1.23 7.54±1.50 Day 2 对照组 Control group 110.29±2.68 20.61±2.55 12.75±1.82 7.22±1.51第3天 试验组Experimental group 144.92±16.35＊＊ 26.17±0.86＊＊ 13.06±2.39 7.46±1.17 Day 3 对照组 Control group 105.00±13.53 19.44±1.01 13.05±0.15 7.01±1.82第4天 试验组Experimental group 184.00±24.20＊＊ 26.87±0.54＊＊ 14.40±1.87 6.77±0.86 Day 4 对照组 Control group 105.42±24.05 18.76±2.56 12.24±1.26 6.52±1.26第5天 试验组Experimental group 139.44±5.96＊＊ 27.95±3.01＊＊ 13.56±1.38 6.89±0.77 Day 5 对照组 Control group 108.91±14.68 20.60±3.22 12.31±2.35 7.07±1.80第6天 试验组 Experimental group 135.51±7.25* 22.99±1.01* 14.12±1.16 6.74±1.91 Day 6 对照组 Control group 117.65±21.77 18.24±2.02 14.45±0.39 6.20±0.69第7天 试验组Experimental group 140.17±16.23＊＊ 23.25±3.23* 13.37±3.53 6.91±1.38 Day 7 对照组 Control group 100.53±14.19 20.42±2.66 13.15±2.58 6.91±0.42第8天 试验组Experimental group 120.95±3.27 26.37±0.69＊＊ 14.09±2.90 6.66±1.56 Day 8 对照组 Control group 106.13±15.11 20.26±3.25 13.79±2.98 6.61±1.07

2.6 鱼诺卡氏菌WPG对乌鳢不同组织中LSZ活力的影响

2.7 鱼诺卡氏菌WPG对乌鳢的免疫保护效应

3 讨论

鱼类属于低等脊椎动物，其非特异性体液免疫因子和吞噬细胞在机体的免疫防御过程中起着主导的作用［8］。有研究表明，鱼类除了白细胞外，其红细胞也具有吞噬功能［19-21］，这在本试验中也得到了证实(图1)。王旭东等［21］认为这主要是因为红细胞和白细胞都来源于造血干细胞，即使后来由于细胞的分化使白细胞获得了各种免疫防御机能，而红细胞则成为携带氧和调节体液酸碱和离子平衡者，但红细胞仍保持了对异物的黏附和吞噬的免疫功能，这可能与它们细胞膜中含有糖基磷脂酰肌醇有关，且红细胞的黏附和吞噬功能在低等动物中更加明显。本试验结果显示， 鱼诺卡氏菌WPG可以较快地刺激乌鳢红细胞和白细胞的吞噬能力，且对红细胞吞噬能力的促进更大，这与温安祥等［22］的研究结果类似。

鱼类补体直接参与机体防御，其生物学活性影响机体抵抗微生物的能力、免疫反应细胞间的通讯联系、免疫复合物的形成和持续时间等，而ACH50是衡量鱼类非特异性免疫力的一项重要指标［23］。本试验结果显示，注射 鱼诺卡氏菌WPG后第1天乌鳢的血清ACH50就极显著升高，在注射后的4 d内均显著高于对照组，这与张璐等［10］、张春晓等［11］、周进等［24］的研究结果基本一致，说明 鱼诺卡氏菌WPG具有激活鱼类补体系统的作用。

表6 注射 鱼诺卡氏菌WPG后乌鳢不同组织中LSZ活力的变化Table 6 The variation of LSZ activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) U/mL

表7 鱼诺卡氏菌WPG对乌鳢的免疫保护效应Table 7 Immune protective efficacy of WPG from Nocardia seriolae on Channa argu

ACP主要存在于肝脏、肾脏、血液、骨骼等组织中，是溶酶体的标志酶;AKP主要存在于骨骼、肝脏和血液中，可催化有机磷酸酯水解，通过改变细菌表面结构增强其异己性，从而被免疫细胞识别达到免疫防御的作用［12，25］，它们都是动物体内参与免疫防御的重要水解酶，可作为衡量动物体非特异性免疫力的指标［9］。本试验结果表明，对照组乌鳢ACP活力肝脏＞肾脏＞黏液，AKP活力肾脏＞肝脏＞黏液，这与周进等［13］的研究结果相似;而 鱼诺卡氏菌WPG能显著提高乌鳢血清、头肾、肝脏、黏液中ACP活力及血清、肝脏中AKP活力，但对头肾和黏液中AKP活力没有显著影响，作者认为这可能与ACP和AKP的功能及它们与不同组织的亲和性等有关。关于表3中部分组织ACP活力出现多峰的现象，作者推测一方面鱼诺卡氏菌WPG作为已知的病原模式分子进入鱼体后可以激活肽聚糖结合蛋白等模式识别受体，从而引起多种免疫应答反应，包括ACP的产生和激活［26］;另一方面ACP是溶酶体中的主要水解酶，而溶酶体具有防御和消化的双重功能， 鱼诺卡氏菌WPG作为机体的异物，在它完成免疫调节作用后必须被消化清除，因而造成了ACP活力的又一次增强;此外，由于鱼类是变温动物，外界环境因素及试验操作都有可能影响其组织中酶的活力，但这些均还需要进一步的试验证实。

SOD主要是清除动物体液或组织中的超氧基，在防御细胞组织超氧阴离子()毒性、生物分子损伤方面起着十分重要的作用［14］。周进等［16］研究表明，牙鲆组织中SOD活力黏液 ＞肝脏＞肾脏，投喂肽聚糖后对肝脏、肾脏、血清中SOD活力没有显著影响，而不同的投喂方式对黏液中SOD活力有显著影响;宋晓玲等［15］的研究发现，肽聚糖能适当提高日本对虾血清中SOD活力，但影响不显著。本研究结果显示，乌鳢在注射鱼诺卡氏菌WPG后肝脏和头肾中SOD活力无显著变化，而血清和黏液中SOD活力均有所升高，作者认为这与SOD的功能有关，因为黏液是机体免疫保护的第1道屏障，而血液可以进入机体的各个组织和器官，因此血清和黏液中SOD活力的升高说明 鱼诺卡氏菌WPG可以促进机体对有毒物质清除的加强，提高机体免疫力［16］。

LSZ由单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞等产生，主要存在于动物的分泌液和血清中，在机体抵抗病原微生物的防御中起着重要作用［27］。本研究结果表明，乌鳢LSZ活力血清＞头肾＞肝脏＞黏液，而注射 鱼诺卡氏菌WPG后乌鳢各组织中LSZ活力都发生了明显的变化，尤其是黏液、血清和肝脏，其LSZ活力在一定时间内升高极显著，但变化趋势不尽相同，这与张璐等［10］、张春晓等［11］和宋晓玲等［15］的研究结果基本相同。Di Luzio［28］认为免疫多糖可以促进单核细胞或巨噬细胞的增生，激活它们分泌LSZ。由于本试验是采用腹腔注射免疫的方法，因此作者推测当注射 鱼诺卡氏菌WPG后乌鳢血液和肝脏组织中的巨噬细胞等首先被激活并进行增生和分泌LSZ，黏液中LSZ主要是鱼体应激分泌产生，而 鱼诺卡氏菌WPG对头肾的作用相对稍晚，短时间内主要是促进免疫细胞的增生和分化，因此头肾中LSZ活力上调没有黏液、血清和肝脏等组织明显。

4 结论

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