排空强饲法测定鸡饲粮表观代谢能值的灵敏度与置信限

王美琴 赵 峰 贾 刚 刘成玲 王钰明 张宏福

(1.四川农业大学动物营养研究所，雅安 625014;2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室，北京 100193)

排空强饲法已被我国采用并作为评定鸡饲料代谢能值的国家标准方法(GB/T 26437—2010)［1］。但是其测试过程繁琐，在单一饲料原料的重复测定中，直接法的最大相对偏差为0.7%～4.6%［2］，套算法则高达 58.5%［3］。由此可见，使用国家标准方法对饲粮间代谢能值的差异进行识别时，尚需要对该方法的灵敏性及置信限等进行进一步分析，以规范其适用范围。目前，在排空强饲法测定鸡饲粮代谢能值的可靠性上，研究工作主要集中在方法的实验室间再现性变异系数［4-5］，重复批次间的批内变异系数、批间变异系数［6］，代谢能值测定的变异因素来源等［6-7］方面。而在排空强饲法的灵敏度上，即样品的代谢能值变化后，排空强饲法所检测到的代谢能值有多大变化?能被排空强饲法所区分的饲粮间表观代谢能(AME)有显著差异的最小值，即样品间AME差异的置信限是多少?这些基础参数仍鲜见相关研究报道。为了检验排空强饲法测定鸡饲粮AME值的灵敏度及样品间差异的置信限，首先需要建立饲粮AME梯度并确定稀释剂与饲粮养分间的互作效应是否可以忽略不计，在此基础上，检验饲粮AME变化后排空强饲法测定AME值的响应量，以检测其灵敏性。然后，根据空白测试、饲粮AME值测定的方差，按照统计学原理估测排空强饲法测定样品间AME值差异的置信限。综合以上2个方面的结果，旨在为排空强饲法测定鸡饲粮AME值的灵敏度与置信限提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计与试验动物管理

本研究分为2个试验，其中试验1旨在考察饲粮中添加一定比例的稀释剂(花生壳)后能否建立相应梯度的AME值，以及排空强饲法能检测到的AME值显著反应量的大小。采用2×5两因素完全随机设计，其中基础饲粮设2个水平，即AME与粗蛋白质水平与NRC(1994)推荐最低需要量相等的饲粮1，AME与粗蛋白质水平比 NRC(1994)推荐最低需要量高10%的饲粮2。稀释剂设5个水平，即在基础饲粮中分别添加2%、4%、6%、8%和10%的花生壳，形成不同AME梯度的10个饲粮。AME测定中选取体重2.0 kg、无怪癖的健康成年海兰褐壳蛋公鸡96只，随机分成4组，每组6个重复，每个重复4只鸡，单笼饲养于代谢笼中，分批次测定试验饲粮的AME值。

试验2通过分析空白样品、灵敏度测试中饲粮AME值的方差是否相等，确定排空强饲法中饲粮AME值标准差的平均值，根据两样本统计显著性原理，计算2个样品间AME值的差异显著时对应的置信限。空白样品测试数据为:考察绝食条件下，即空白样品条件下，假定强饲50 g(风干物质)完全不消化的饲粮样品为空白样品，测定空白样品的AME值。选取体重2.0 kg、无怪癖的健康成年海兰褐壳蛋公鸡96只，随机分成4组，每组8个重复，每个重复3只鸡，单笼饲养于代谢笼中，分4个批次重复测定内源能的排泄量。灵敏度测试数据为试验1中的代谢试验数据。

所有试验动物均自由采食，通过乳头饮水器自由饮水，每日光照12 h，代谢室的温度维持在25℃。日常管理按照动物营养学国家重点实验室的常规饲养管理程序进行。代谢试验期间按GB/T 26437—2010进行管理。

1.2 试验饲粮组成及营养水平

试验饲粮组成及营养水平见表1。

1.3 代谢试验过程

代谢试验过程参照GB/T 26437—2010，具体操作程序:代谢试验预试期3 d，最后1次饲喂试验饲粮;排空48 h后强饲试验饲粮50 g(精确到0.000 2 g)，并准确记录每只试验鸡的强饲结束时间;排泄物收集48 h后，试验鸡进入10 d以上的恢复期，恢复期及预试期前2天饲喂玉米-豆粕型基础饲粮(表1)，并自由饮水。排泄物的制备与分析:排泄物收集完成后，立即将其置于65℃的烘箱中烘干至恒重，回潮24 h后将每个重复内鸡的风干排泄物总量称重记录，并粉碎过40目筛，立即取部分样品按照GB/T 6435—1986测定其干物质(DM)含量，并计算鸡的DM排泄量。其余样品封装后置于-20℃冰箱保存待进一步分析;总能的测定根据ISO 9831∶1998的规定进行，并同步测定排泄物的DM含量。

1.4 数据处理与统计分析

被测饲粮AME的计算:

式中:GE1为摄入总能(J);M1为摄入DM量(g);GE2为排泄物总能(J);AME为被测饲粮AME(MJ/kg DM)。

以SAS 9.0的MEANS模块对数据进行分析，采用ANOVA模块对方差的齐次性进行Levene’s检验。GLM模块对饲粮中稀释剂水平与AME的线性关系、二次方关系及线性失拟进行检验。采用REG模块对饲粮AME实测值与计算值的线性关系进行回归分析。

2 结果与分析

2.1 以花生壳为稀释剂建立饲粮AME梯度的检验

在NRC(1994)推荐的最低AME与蛋白质水平饲粮(饲粮1)与高AME高蛋白质水平饲粮(饲粮2)条件下，随着花生壳(稀释剂)水平以2%的梯度增加，饲粮的AME值依次降低。由表2可知，饲粮来源(饲粮1、2)和稀释剂的水平对稀释后饲粮的AME值均有显著影响(P＜0.01)，但两者对稀释后饲粮的AME值无显著交互效应(P=0.056 9)。由此可见，2种饲粮在AME值上的显著差异与本试验设计中饲粮1与饲粮2在AME与蛋白质水平上相差10%相对应，并且在稀释剂添加水平相同的情况下，稀释后的2种饲粮仍呈现差异。在稀释剂水平与饲粮AME值的关系上，假设稀释剂(花生壳)的AME值为0，则对10个稀释后饲粮AME计算值(AMEc，根据饲粮1、2 AME的实测值乘以稀释后饲粮中饲粮1、2的含量)与排空强饲法AME实测值分别作T检验，两者的差异均不显著(P＞0.05)，这表明花生壳可以视为AME值为0的纯稀释剂，也进一步说明，花生壳对稀释后2种饲粮的AME值的影响是相似的(即无互作效应)。2种饲粮条件下，稀释剂的水平(2% ～10%)对稀释后饲粮的AME值呈显著的线性关系(P＜0.01)，而二次函数关系与线性失拟检验均不显著(P＞0.05)。综合上述分析，通过增加稀释剂的水平可以线性地建立不同AME梯度的饲粮。

表1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

2.2 排空强饲法测定饲粮AME值的响应量

在以花生壳为稀释剂建立饲粮AME值的梯度中，已得出稀释剂的水平与饲粮来源对稀释后饲粮的AME值无互作效应，且花生壳是AME值为0的稀释剂。因此，在检测排空强饲法对饲粮AME值的响应量上，可以将10个饲粮视为属于同一个系统。根据前述统计分析，在确定稀释后饲粮AME的理论值上，通过排空强饲法(国家标准方法)测定饲粮1、2的AME值，然后按照稀释后饲粮中稀释剂的比例依次计算得出相应的AMEc。根据化学分析中灵敏度的含义，引申AME值测定的灵敏度为被测饲粮AME改变1个单位AMEc的变化值(dAMEc)时所引起的排空强饲法检测到的AME的变化值(dAME)，即 m=dAME/dAMEc。以AMEc为依变量，以排空强饲法AME实测值为应变量作线性回归分析(图1)，得出dAME/dAMEc=0.987(P＜0.01)，这表明，排空强饲法检测到的AME值对饲粮AME值的变化具有较高的灵敏度。

表2 稀释剂的水平对饲粮AME值的影响Table 2 Effects of the level of diluent on dietary AME value MJ/kg DM

2.3 排空强饲法测定饲粮样品间AME值差异的置信限

在AME值测定中，由于难以规范完全不消化的空白样品实物，因此，空白样品AME为假设强饲50 g完全不消化的饲粮样品(本试验中饲粮DM含量为93.3%)所测得的 AME值，AME=(FEI-FEO-EEL)/(50×0.933)(式中，FEI为50 g空白饲粮的能量摄入量;FEO为空白饲粮来源的粪尿能排泄量;EEL为内源能排泄量)。由于空白饲粮是完全不消化的，因此FEI=FE o，空白饲粮AME=-EEL/(50×0.933)。根据该公式，采用绝食法收集内源排泄物可以测定空白饲粮的AME值。本研究中(表3)，通过4个批次，测定每只成年公鸡的内源能排泄量为57.29～70.56 kJ，批次间内源能排泄量差异不显著(P＞0.05)。相应地，4个批次中，空白饲粮的AME值为-1.51～-1.23 MJ/kg DM，平均值为-1.38 MJ/kg DM。

图1 饲粮AME实测值对AMEc的响应量Fig.1 The response of determined AME value to AMEc

在空白样品(内源能排泄量)测定中，4个批次中样品 AME的标准差在 0.16～0.38 MJ/kg DM，平均值为0.26 MJ/kg DM，批次间AME方差的差异不显著(P=0.279 7)，这表明试验鸡内源能排泄量的变异是稳定的。在10个饲粮的测定中，AME的标准差在0.11～0.24 MJ/kg DM，平均值为0.19 MJ/kg DM，饲粮AME间方差的差异不显著(P=0.873 7)，这表明，排空强饲法测定饲粮AME的变异是稳定的。通过对空白样品与饲粮测定中AME的方差进行比较，得出两者的差异也不显著(P=0.400 7)。由于排空强饲法中，饲粮的摄入量变异很小，所以饲粮AME值测定的变异主要来源于排泄物质量的变异［6］。由此可以得出鸡内源能排泄量的变异与饲粮测定中粪尿能总排泄量的变异是接近的。

表3 绝食法测定空白样品的AME值Table 3 The AME value of blank sample using fasting method

根据统计分析中2个样本差异比较的显著性检验原理［9］，当2个样品AME的差值大于集合标准误的2.228倍时(df=10，α=0.05)，表明样品的AME存在显著性差异。因此，可以将该统计量作为排空强饲法测试饲粮样品间AME差异的置信限。本试验中，14次AME测定的方差无统计显著性差异(P＞0.05)，因此，将其平均值作为普通样本的方差估计值，则2个样本间的集合标准误为 0 .21=0.12 MJ/kg DM，置信限为2.228×0.12=0.27 MJ/kg DM。

3 讨论

3.1 排空强饲法测定饲粮AME值的灵敏度

从方法学的角度看，方法的可靠性需要从准确度、精度、线性(灵敏度)、置信限等方面进行综合评估［10］。目前，在生物学法测定家禽饲粮代谢能值的重复性(精度)上已开展了许多研究工作［2，4-6］，而在方法的线性灵敏度上，以往的研究主要集中在几种饲料原料间代谢能值的可加性研究［11-14］上。基本原理是通过单样本T检验，比较2种或多种原料混合后饲粮的代谢能实测值与根据单一原料代谢能实测值及饲粮中原料组成比例计算出的代谢能值，得出方法是否具有可加性。然而，对几个饲粮进行可加性检验难以确定生物学法在多大范围内呈现线性可加性，以及对饲粮的代谢能值发生变化后所测试到的代谢能值的反应量也难以定量，因此，生物学法的可加性检验并不能说明方法的灵敏度。本研究中，在2种饲粮中加入2% ～10%的花生壳，使10个饲粮的AME值在12.14～14.13 MJ/kg DM的范围内呈梯度变化，通过排空强饲法检测到饲粮的AME值在12.01～13.91 MJ/kg DM相应变化，AME实测值对计算值的比例为0.987。这表明当饲粮AME在2%的梯度以上变化时，排空强饲法能灵敏地反映 其变化。

表4 空白样品和饲粮AME测定的方差齐次性检验Table 4 Homogeneitytest of AME variance of blank sample and diets MJ/kg DM

3.2 排空强饲法测定饲粮样品间AME值差异的置信限

在对2个或2个以上饲料原料或饲粮样品的代谢能值进行比较时，通常采用生物统计的两样本T检验或方差分析的多重比较得出结论。但目前仍鲜见排空强饲法可准确分辨饲料原料或饲粮间AME有显著差异的最小值，即样品间AME值差异的置信限。本试验通过对4次绝食代谢内源能排泄量及10个饲粮AME值的方差比较，得出了饲粮间AME值的方差、内源能排泄量的方差均无显著性差异。这表明排空强饲法测定饲粮AME值时，测试结果的变异是稳定的。由此得出，对饲粮而言，排空强饲法能区分样品间AME值存在显著差异时所需要的最低差值为0.27 MJ/kg DM，即为饲粮AME值的2.1%。而将Sibbald［11］对10个鸡饲粮的真代谢能(TME)值测定的标准差进行与本试验相同的分析后，得出排空强饲法测定饲粮样品间 TME值差异的置信限为0.28 MJ/kg DM。由此可见，将0.27 MJ/kg DM作为排空强饲法测定饲粮间AME值差异的置信限是合适的。而对单一原料而言，直接法可测定的原料如谷实类饲料，因其营养物质组成不如饲粮平衡，排空强饲法测定AME值的方差可能比饲粮高，相应地，区分饲料间AME值显著差异的置信限比0.27 MJ/kg DM大一些。对套算法测定的饲料原料而言，因假设基础饲粮的AME值是稳定的，待测饲料在试验饲粮中占的比例在20%以上［15］，相应地，区分饲料间AME值显著差异的置信限最高可达0.27/0.2=1.35 MJ/kg DM。因此，对排空强饲法测定单一饲料原料的样品间AME值差异的置信限还需要进一步确定。

4 结论

①排空强饲法测定饲粮的AME值具有满意的灵敏度。

②排空强饲法测定饲粮样品间AME值是否有显著差异的置信限为0.27 MJ/kg DM。

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