尖吻蝮蛇毒PCA在急性心肌梗死诊断中的应用

王 斐，张根葆，2，黄 璐，徐 平，皇甫政彤，吴 娟

(皖南医学院 1．病理生理学教研室;2．蛇毒研究所，安徽 芜湖 241002)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠状动脉血供急剧减少或中断，相应的心肌急性缺血导致心肌坏死［1］。急性心肌梗死诊断主要依据临床表现、病史、心肌的生化指标以及心电图改变等［2］。近年来，蛋白C系统在AMI发生发展中的研究越来越受到科研人员关注，蛋白C活性降低与AMI的发生发展有密切关系，对蛋白C活性的动态监测将反映AMI的严重程度［3］。蛋白C是一种维生素K依赖的糖蛋白，在肝脏中合成，生理条件下以无活性的酶原形式存在于血浆，在凝血酶与血栓调节蛋白复合物(凝血酶-TM)的作用下催化为活化蛋白C(APC)，从而发挥抗凝活性［4］。内皮细胞蛋白C受体(EPCR)与蛋白C结合可使蛋白C活化程度极度增强，从而更显著地发挥抗凝活性。相关报道指出，在天然蛇毒提取物中发现了多种能特异性激活蛋白C的激活剂，部分激活剂已用于基础研究及临床诊断。本室从尖吻蝮蛇粗毒中分离纯化出的蛋白C激活剂［5］，根据蛋白C活性检测原理，研制出PC活性检测试剂，前期实验［6］表明能有效激活血浆蛋白C，并与进口蛋白C检测试剂生物学活性相似、结果稳定等。因此，本研究将通过建立大鼠急性心肌梗死模型，通过本室研究的蛋白C激活剂，运用发色底物法检测AMI大鼠血浆蛋白C活性变化，探讨蛋白C活性检测试剂在AMI诊断的应用，为进一步将PC活性检测试剂应用于基础研究及临床诊断提供理论及技术支持。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 动物 SD雄性大鼠，体质量(200±30)g，由苏州市工业园区爱尔麦特科技有限公司提供，许可证编号:SCXK(苏)2009-0001。

1．1．2 药品与试剂 蛋白C激活剂(PCA)由皖南医学院蛇毒研究所提供;血管内皮细胞蛋白C受体(EPCR)试剂盒购自美国Assay公司;活化部分凝血活酶时间(APPT)检测试剂盒购于上海太阳生物技术有限公司。

1．1．3 仪器 Model-680酶标仪(美国伯乐公司);FA1604N电子天平(上海民桥精密科技仪器有限公司);HX-300S型动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司);Medlab/8C生物信号采集处理系统(南京美易科技有限公司);MC-2000双通道凝血仪(美国伯乐公司);低温高速离心机(北京医用离心厂)等。

1．2 方法

1．2．1 动物分组 30只雄性SD大鼠随机分为3组(n=10)，即对照组(C组)、假手术组(S组)、急性心肌梗死模型组(AMI组)。

1．2．2 模型复制 心肌梗死模型组雄性SD大鼠，称重后腹腔注射3%戊巴比妥钠(0．1/100 g)麻醉，仰卧位固定于大鼠台，链接MedLab信号处理系统监测心电变化。颈部手术，分离左右颈总动脉及行气管切开术，气管插管后接动物呼吸机辅助呼吸。心电变化平稳5 min后，以大鼠左胸第4、5肋间为手术切口，依次切开各层，暴露肋骨，破胸膜，撕开心包膜，轻压腹腔及胸廓挤出心脏，用6-0号手术线于动脉圆锥与左心耳交界稍下1～2 mm处迅速结扎左冠状动脉前降支，迅速将心脏放回胸腔，于心脏表面滴2～3滴利多卡因，MedLab信号处理系统监测S-T段弓背向上明显抬高，表明心肌梗死模型制备成功，关闭切口，缝合各层皮肤;S组SD大鼠模型复制仅开胸不进行心脏结扎。

1．2．3 标本采集及指标检测 分别在模型制造后0．5 h、1 h、2 h、4 h 颈总动脉取血，用 3．8% 枸橼酸钠(1∶9)抗凝，离心15 min(3 000 r/min)收集血浆在4 h内检测活化的部分凝血活酶时间(APTT)指标。离心30 min(3 000 r/min)，收集血浆冰冻保存，用于其他指标检测。

1．3 统计学处理 使用SPSS 17．0统计软件处理，实验数据以均数±标准差(¯x±s)表示，多组均数比较用单因素方差分析，两两比较用SNK-q法，以P＜0．05表示具有显著性差异的标准。

2 结果

2．1 心肌梗死模型复制 图1B显示:S组心率增快;图1C显示:AMI组S-T段弓背向上抬高，QRS波群形态改变，T波增高。图2C显示:镜下观察心肌组织部分细胞排列絮乱，细胞核固缩。

2．2 SD心梗大鼠血浆蛋白C活性变化 从图3可见，AMI组在模型制作成功1 h时，血浆PC活性(66．67 ±5．25)%较蛋白 S 组(73．8 ±5．3)%、C 组(74．2 ±3．8)%下降(P ＜0．05)，4 h 时 AMI组血浆蛋白 C 活性为(57．4±1．89)%、S组(72．7±2．9)%、C 组(73．2 ±3．48)%，AMI组血浆 PC 活性较S组、C组下降更加显著(P＜0．01)，表明心肌梗死发生时，蛋白C系统受到影响，并且进一步表明血浆PC活性下降的程度与AMI的发生相关。

图1 Medlab生物信号采集系统检测SD大鼠心电变化A:C组心电图正常;B:S组心电图显示心率增快;C:AMI组心电图显示S-T段弓背向上抬高，QRS波群形态改变，T波抬高Fig 1 ECG movement in SD rats detected by Medlab bio-signal operating systemA:Normal ECG for the control group;B:Increased heart rate in the sham operation group;C:Arched elevation of S-T segment in AMI group．QRS waves are changed，and T waves are elevated

2．3 SD大鼠活化的部分凝血活酶时间(APTT)指标变化 从表1可见，AMI组与 C组、S组比较，APTT在AMI发生2 h时开始缩短，4 h明显缩短，差异具有统计学意义(P＜0．05)。

2．4 SD大鼠血管内皮蛋白C抗体(EPCR)含量变化 从表2可见，AMI组大鼠血浆EPCR含量与S组、C组比较，在心肌梗死后2 h开始升高，差异具有统计学意义(P＜0．05)，4 h时大鼠血浆EPCR含量显著升高，差异具有显著统计学意义(P＜0．01)。

图2 SD大鼠心肌病理切片(HE染色，×40)A:C组心肌组织正常;B:S组心肌组织正常;C:AMI组心肌组织，显示部分细胞排列絮乱，细胞核固缩Fig 2 Myocardial pathological section for SD rats(HE，×40)A:Normal myocardial tissue from the control group;B:Normal myocardial tissue from sham operation group;C:AMI group shows that pathological cardiac muscle cells are arranged in disorder，with fractured myofilaments and cell nucleus pyknosis

图3 大鼠血浆蛋白C活性变化的组间比较(¯x±s，n=10)Fig 3 Comparison of the plasma protein C activity changes in SD rats(¯x±s，n=10)

表1 SD大鼠活化的部分凝血活酶时间(APTT)指标变化(¯x±s，n=10)Tab 1 Comparison of APTT indicators among AMI model group，Sham operation group and Control group(¯x±s，n=10)

表2 AMI模型组血浆EPCR含量与对照组比较(¯x±s，n=10)Tab 2 Comparison of the plasma EPCR levels among AMI model group，Sham operation group and Control group(¯x±s，n=10)

3 讨论

急性心肌梗死绝大多数与冠状动脉粥样硬化病变有关，血栓形成是大多数急性心肌梗死的病理生理基础［7］。如何早期诊断，特别是早期预测AMI的发生与发展，并结合有效的治疗是改善预后降低病死率的重要手段［8］。近年来，愈来愈多的研究报道，蛋白C的缺失或下降与血栓性疾病的发生发展密切相关［9］，但目前关于蛋白C活性在AMI中的连续变化的研究报道较少，可能与蛋白C活性检测试剂的商品化产品很少［10］，国外进口价格昂贵有一定的关系。

本研究发现，AMI组心电显示S-T段弓背向上抬高，QRS波群形态改变，T波增高;病理切片心肌组织镜下观察显示细胞排列絮乱，细胞核固缩，确认了AMI模型制造成功。实验中发现，AMI组在模型制作成功1 h时，血浆 PC活性(66．67±5．25)%较蛋白 S组(73．8 ±5．3)%、C 组(74．2 ±3．8)%下降(P＜0．05)，4 h时 AMI组血浆蛋白 C活性为(57．4±1．89)%、S 组 (72．7 ± 2．9)%、C 组(73．2±3．48)%，AMI组血浆 PC 活性较 S组、C 组下降更加显著(P＜0．01);APTT在AMI发生2 h时开始缩短，4 h明显缩短，提示蛋白C活性参与AMI的发生发展，其异常变化比凝血指标出现得更早、更敏感。与此同时，内皮细胞蛋白C受体(EPCR)于AMI发生2 h时开始升高，4 h显著升高，提示AMI发生早期可能由于冠状动脉阻塞导致相应心肌缺血缺氧，凝血系统被激活，同时启动抗凝系统，血浆中无活性蛋白C被激活为活化蛋白C，血浆蛋白C被大量消耗;在这个过程中缺血区相应部位血管内皮受损，释放大量EPCR进入血液，与血液中无活性蛋白C结合，增快蛋白C的消耗，进一步提示蛋白C下降程度与AMI的严重程度具有密切联系。因此，监测血浆蛋白C活性及动态变化对AMI的早期诊断及预后具有重要的临床应用价值。

目前PC的检测方法主要有发色底物法(CSA)、抗原测定法及活化部分凝血活酶(APTT)法［11］。CSA与其他方法比较，更灵敏，可重复强，专一性高，是首选方法［12］。本室从尖吻蝮蛇粗毒中分离纯化出的蛋白C激活物，可特异性激活血浆蛋白C［13］，在体外快速反应血浆中蛋白C的活性变化。因此，以尖吻蝮蛇毒PCA制备的血浆蛋白C活性检测试剂应用CSA可较灵敏地反映心肌梗死大鼠血浆蛋白C活性的变化。

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