大鼠脑内双核团电活动与多项生理指标的同步记录技术

刘 伟，汪伟伟，黄 军，汪萌芽

(皖南医学院 1．细胞电生理研究室;2．生理学省级重点学科“启明星小组”，安徽 芜湖 241002)

人类的生命活动涉及生理活动和心理活动两方面，这种心理生理活动的统一性，也表现在诸多心理生理障碍和心身性疾病中，如药物成瘾、创伤后应激障碍等。以药物成瘾为例，其既包括精神依赖(psychological dependence)也包括躯体依赖(physical dependence)。躯体依赖可以随着各种戒毒方法的应用渐渐消退，但精神依赖却可长久存在，导致成瘾者再次使用成瘾药物(复吸)［1］。成瘾中精神依赖和躯体依赖的关系尚不清楚，有学者认为精神依赖先出现，在反复的线索、奖赏诱导下才出现了躯体依赖;但也有人提出至少在烟草成瘾中精神依赖和躯体依赖是平行发生的［2］。目前关于药物成瘾的研究既有心理角度的摸索也有生理方面的探究，但多为分别进行，仅偶见报道称心理活动与生理活动的解偶联(decoupling)可能是成瘾机制之一［3］。同样，创伤后应激障碍除了心理障碍外，通常也伴有神经系统的结构和功能改变，并引发躯体症状。由此可见，药物成瘾等精神类疾病或心身疾病的研究，亟需一种心理生理学综合技术来较系统地揭示其可能的发病机制。为此，我们以药物成瘾为例，选择了与药物成瘾密切相关的脑内奖赏和惩罚系统代表性核团进行同步细胞外记录，并联合多项生理指标记录的技术，为进一步对药物成瘾的精神依赖和躯体依赖以及其他精神性疾病，从心理和生理两方面同时进行实验研究奠定基础。

1 材料和方法

1．1 实验动物 选用280～300 g成年SD大鼠26只，雌雄不拘，由南京青龙山动物繁殖场提供。

1．2 仪器设备及药品 常规动物手术器械、双层铜网电生理屏蔽罩和防震台、手术显微镜、脑立体定位仪、牙科钻和保温毯(上海奥尔科特生物科技有限公司)。不锈钢同芯金属电极、金属参考电极和微电极放大器、PowerLab八通道生理信号采集与分析系统(AD Instruments，Australia)及其 Chart Pro记录和分析软件、20%乌拉坦等。

1．3 实验方法

1．3．1 多项生理指标同步记录 取大鼠用20%乌拉坦按1．5 g/kg剂量腹腔注射麻醉，麻醉稳定后，将大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪上，下垫保温毯(设定温度37．0℃)，放置在双层铜网电生理屏蔽罩内的防震台上。将体温换能器探头置于大鼠肛门内，进行体温信号的采集。在大鼠右前肢用针式电极插入腕关节上部的前臂皮下，左后肢用针式电极插入踝关节上部的大腿皮下，右后肢接地，记录标准肢体Ⅱ导联心电图。将2根针式电极插入大鼠右侧腋中线第9肋下缘肋间外肌内，记录呼吸肌肌电图。将2块板式皮肤电导电极，用医用胶布分别固定于大鼠左前肢掌面和背面，记录皮肤电导。

1．3．2 脑深部双核团细胞外记录 头部备皮。调节耳杆使之左右对称，固定大鼠头部使之不能移动。用手术刀切开头皮，3%H2O2擦拭充分止血，暴露颅骨标志(前囟、人字缝)。调节前囟、人字缝到同一水平平面。定位腹侧背盖区(VTA):前囟后(AP)－6．72 ～ －6．84 mm;右旁开(R)0．4 ～1．13 mm;硬膜表面以下(DV)7．5 mm～8．5 mm。定位基底外侧杏仁核(BLA):AP －1．56 ～ －3．36 mm;左旁开(L)3．9 ～4．6 mm;DV 7．8 ～8．82 mm［4］。以牙科钻钻颅开窗，手术显微镜下用显微剪剪开硬脑膜、蛛网膜和软脑膜，3%H2O2充分止血。使用金属电极在操作臂的牵引下移至颅窗上，并紧贴脑组织，2%盐水琼脂封窗。安置好参考电极、接地电极。记录电极接入放大、记录系统。操纵电极下至目标脑区后，微调电极寻找合适、明确的细胞外电活动信号。

1．3．3 信号采集参数设置 所采集的6通道信号，经换能器或放大器放大，接入PowerLab多导生理信号采集与分析系统，由计算机中Chart Pro软件进行采集、存盘，采样频率4 kHz。各通道参数设置如下:VTA、BLA电活动信号高通10 Hz、低通2 kHz，体温信号低通10 Hz，心电信号高通10 Hz、低通200 Hz，呼吸肌肌电信号高通 0．1 Hz、低通 200 Hz，皮肤电导信号量程设为10μS。

实验结束，取脑于4%甲醛溶液内固定或冰冻后，进行冠状面切片，观察针道位置与图谱VTA、BLA的位置进行比对，进行记录位点鉴定。

1．4 数据分析 记录到的脑内核团电活动信号，用Chart Pro软件进行数据测量和分析，并作有关指标的相关性分析等。幅值为Chart Pro软件从选定时间内检测的信号幅度最大值减去最小值，即信号的最大振幅值。呼吸肌肌电周期计算，使用Chart Pro软件中周期测量(Cyclic measurements)功能，最小峰高S．D．设为5、滤波设为高通150 Hz、最小周期设为720 ms，将数据添加到数据板，可自动算出均数，即为平均肌电周期(代表呼吸频率)。结果以¯x±s表示。用 Origin 5．0软件(Microcal Software Inc，USA)进行相关数据的统计分析和作图。P＜0．05为差异有显著性意义。

2 结果

2．1 6通道同步记录在对脑内VTA、BLA核团电活动进行同步细胞外记录的同时，监测体温、心电、呼吸肌(肋间外肌)肌电、皮肤电导等生理指标，1只大鼠典型的6通道同步记录结果例示于图1。

图1 单只大鼠的6项心理生理学指标同步记录A为常规显示，从上到下依次为:VTA电活动(μV)、BLA电活动(μV)、体温(℃)、心电(μV)、呼吸肌肌电(μV)，皮肤电导(μS)。B为A图中相应生理指标(虚线框)的放大

图2 VTA和BLA同步记录的放电频率直方图(Bin=10 s)

2．2 VTA和BLA电活动特性及其相关性分析 放电频率直方图分析是细胞外记录的主要分析方法，用以反映核团或神经元电活动的频率，进而了解核团电活动的特性。1只大鼠VTA和BLA电活动记录的典型放电频率直方图分析例示于图2。对26只大鼠各取稳定记录的VTA和BLA电信号20 min，用Chart Pro软件检测出平均频率作为放电频率值，结果显示BLA的放电频率(0．88±0．99)Hz高于 VTA(0．50 ±0．55)Hz，配对 t检验，P ＜0．01。进一步进行相关分析(图3)，表明BLA放电频率与 VTA放电频率呈正相关(r=0．936，P＜0．01)。进一步对12只大鼠进行6个通道记录指标的分析，亦显示不仅BLA的放电频率，其电活动的幅值也高于 VTA(P ＜0．01，表1)。

2．3 生理指标分析在12只大鼠进行6个通道记录指标的分析中，同步记录的4项生理指标是体温、皮肤电导、心电图和呼吸肌肌电图。应用Chart Pro软件对大鼠心电图、肌电图等生理指标进行分析，其呼吸肌肌电、体温、皮肤电导和心电信号的基本测量结果列于表2。

图3 大鼠VTA和BLA放电频率的相关性分析

表1 大鼠VTA和BLA电活动检测结果(n=12)

表2 大鼠呼吸肌肌电、体温、皮肤电导、心电信号检测结果(n=12)

2．4 VTA和BLA电活动与生理指标间的相关性应用本技术不仅可以分别对脑内核团间的电活动进行相关性分析，同时还可以进行脑内核团电活动与生理指标间的相关性分析。图4例示了脑内VTA和BLA电活动与生理指标的相关性记录结果，图中箭头所指处先出现VTA和BLA电活动的明显减弱，接着出现呼吸肌肌电活动的明显增强，随后1个间歇期延长，呈现1次呼气后期的深吸气过程，称之为“自发深呼吸反应”，与实时观察动物活动一致，并伴有明显的皮肤电导反应。

为进一步分析上述现象，连续观察稳定信号，取自发深呼吸反应期2 s，其前对照期2 s，进行VTA和BLA核团电活动、心电、肌电、皮肤电导、体温等指标同步变化情况的参数检测和分析。由图4可见，各指标的幅值检测呈现反应期脑内核团电活动首先减弱，随即呼吸肌肌电活动增强，其后皮肤电导幅值增大。表3的数据分析表明，反应期的VTA电活动幅值减小(P＜0．05)，呼吸肌肌电幅值增大(P＜0．01)和皮肤电导幅值增大(P＜0．01)，同时 BLA电活动幅值有减小趋势(P=0．07)。但心电指标的变化没有显著性意义(P＞0．05)。图4的各指标变化时间顺序，结合表3的数据分析，表明这种反应的发生可能是源于中枢神经系统活动的改变，继而导致生理活动的变化。

图4 脑内VTA和BLA电活动改变引起的外周生理指标变化

表3 大鼠自发深呼吸反应期各指标的变化(¯x±s，n=9)

2．5 伤害性刺激的影响 为检测本技术能否反映外周伤害性刺激诱发的心理生理反应，记录过程中使用充分绝缘后的血管钳夹持大鼠尾巴后1/3处(夹尾刺激)作为伤害性刺激，强度以后肢抽动为适宜强度。以夹尾刺激前各指标信号为基础水平(100%)，对夹尾时、夹尾后信号作归一化处理，再进行统计学分析(n=12)。

由图5可知，与基础水平相比VTA放电频率在夹尾时比夹尾前显著性降低(P＜0．001)，夹尾后比夹尾前显著性升高(P＜0．05)。BLA放电频率在夹尾刺激时降低(P＜0．05)，刺激停止后发放频率恢复并有超过基础水平的趋势。

图5 夹尾刺激诱发的VTA和BLA放电频率变化

对夹尾刺激过程中的BLA和VTA电活动幅值进行分析显示(图6)，夹尾时BLA和VTA电活动幅值相比夹尾前均下降(VTA:P＜0．001，BLA:P＜0．01)，夹尾刺激结束后BLA和VTA电活动幅值都回升(VTA:P ＜0．001，BLA:P ＜0．01)。

图6 夹尾刺激诱发VTA和BLA电活动幅值的变化

同时，对夹尾刺激诱发生理指标的变化进行分析显示(图7)，心电信号RR间期与夹尾前相比在夹尾时显著性缩短(P＜0．01)，刺激结束后虽然有所恢复，但仍短于夹尾前(P＜0．05)。呼吸肌肌电幅值在夹尾时仅有升高的趋势(配对t检验，P=0．11)，夹尾后比夹尾前降低(P ＜0．001)。其他指标如R波幅值、皮肤电导幅值(数据未显示)等的变化均没有显著性意义。

图7 夹尾刺激诱发RR间期、呼吸肌肌电幅值的变化

3 讨论

基于心理活动与生理活动相统一的心理生理学观点，以及利用多导生理记录仪记录皮肤电导、心率、脉搏、心电、呼吸、面部肌电和脑电等信号来进行人的情绪评估等心理生理学技术［5］，本文报道了在麻醉大鼠进行脑内双核团细胞外记录和多导生理指标同步记录的技术，其中脑内核团选择了与药物成瘾密切相关的脑内奖赏系统与惩罚系统代表性核团VTA和BLA电活动为例，与多项生理指标的活动观察相结合，进行相互关系的分析，结果表明是一种可行的综合性心理生理学研究技术。

实验结果显示本方法可以较好地同步记录脑内VTA与BLA双核团电活动和多项生理活动信号，并对这些信号进行系统地分析(如心电、肌电)，也可以做与其他信号之间的相关性分析。在实验中，没有使用传统有创的气管插管法和膈肌肌电活动评估呼吸功能的做法，而是改进了文献报道的“打开腹腔从腋前线第9肋骨下缘刺入电极，不会穿透胸膜伤及肺”的操作［6］，直接将电极经皮插入相应位置，记录肋间肌肌电活动。本文所检测到肋间肌肌电频率与同等条件下大鼠呼吸频率相符，各项指标均与相关报道基本一致［7－11］。

本文还观察到大鼠的自发深呼吸反应现象。从记录结果看，先出现脑内核团电活动改变，继而呼吸肌肌电幅值升高、皮肤电导幅值增大。从各指标变化时间顺序来看，可能是VTA和BLA核团电活动的改变导致了外周生理活动反应，这无疑为本技术作为心理生理学动物实验方法的建立提供了支持。从自发深呼吸反应的现象看，推测可能是中枢缺氧导致的脑内神经活动受到抑制，进而诱发一次深呼吸反应。不过，本文尚未能对该现象的机制和意义进行分析，有待于进一步的研究。此外，伤害性夹尾刺激诱发的反应则是由外周刺激引发的脑内活动改变和生理活动变化，而VTA和BLA核团与伤害性刺激引起的痛觉反应也密切相关，故以此了解本实验技术对外周刺激诱发反应的监测情况。结果显示VTA和BLA电活动都在夹尾时受到抑制，夹尾后恢复并超过原来基础水平，但不同核团对刺激的响应程度不同。与此类似，不同的生理信号对夹尾刺激的反应也不同，心电RR间期在夹尾时减小，夹尾后逐渐升高，呼吸肌肌电幅值则在夹尾时有升高趋势，夹尾后降低，显示了伤害性夹尾刺激可引起一定特异性生理反应。以上结果说明，本文所建立的大鼠脑内双核团细胞外记录与多项生理指标联合记录的心理生理学实验技术，既可以检测由脑内活动变化引发的外周生理活动改变，也可以反映外周刺激诱发的中枢及外周生理活动变化。

本实验表明，该实验方法的特点表现在一方面可以在活体动物上同时对两处深部核团进行细胞外电信号记录，进而在整体条件下进行相关功能核团间的相互作用分析，以药物成瘾研究为例，就可以进行脑内奖赏和惩罚系统相关核团功能联系和相互影响的分析。另一方面可以实现多项生理指标同步记录，不仅可以了解脑内功能活动对外周生理功能的影响，而且能通过多项生理功能的比较分析其反应模式的特异性，实现心理生理学研究的目标。以药物成瘾研究为例，不仅大鼠药物成瘾出现戒断反应的体征［12］可反映在所检测的生理指标变化上，同时有关“心理-渴求偶联”在成瘾者中会发生改变［13］的特征亦可得到观察，故能较为全面地分析药物成瘾躯体依赖导致的生理指标变化。由此可见，该实验技术是从心理学和生理学交叉技术的角度，联合分析心理生理指标，为药物成瘾等心身疾病机制的综合性研究提供了一种实用的技术。

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