通腑解毒法调节大鼠脑缺血/再灌注损伤后炎症反应及神经保护机制

李云波

缺血再灌注损伤首先由Jennings于1960年提出, 脑缺血再灌注损伤是指缺血脑组织在恢复血液灌注后, 脑组织损伤进一步加重［1］。大量研究表明, 脑缺血/再灌注损伤主要与炎症反应、神经细胞凋亡、氧化应激、钙离子超载等有关［2］。

大量研究表明：脑梗死急性期血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)浓度明显增高。中医对脑缺血的治疗有不可替代的优势, 但作用机制不十分清晰, 本实验试图从炎症反应机制来诠释通腑解毒法对急性缺血性中风可能的神经保护作用机制, 为揭示中医药促进脑梗死恢复作用机制提供重要依据。

1 材料与方法

1. 1 实验动物分组及模型建立 健康雄性（Sprague-Daw）大鼠 50 只 , SPF 级 , 体质量 250～300g, 由广东省卫生厅实验动物中心提供。合格证号：0045633 。通腑醒神胶囊(非上市药物, 广东省中医院制剂, 国家食品药品监督局批准研究用)主要成分：番泻叶、虎杖、人工牛黄、天竺黄、栝蒌仁等药物组成。随机分为三组 A假手术组(10只)、B模型对照组(20只)、C通腑醒神胶囊干预组(20只)。采用大脑中动脉(MCA)阻塞方法制备大鼠脑缺血/再灌注损伤模型。通腑醒神干预组与模型对照组均按上法造模。缝合切口。立即灌胃给药：通腑醒神干预组：配成1g/ml药物溶液, 0.2ml/100g灌胃；假手术组同模型对照组给予相同量0.9%生理盐水。

1. 2 指标观察与评价 动物行为学变化和神经缺损功能测定:在造模术后不同时间点(术后2 h、术后24 h、术后 72 h、术后1 w)按下列两种方法进行行为检测。LongaEZ［3］的5分制评分标准。

1. 3 动物处理及取材 两周后, 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 m l/kg)麻醉, 断头取脑, 置于标本瓶-20℃保存。样品处理：取右脑组织倒入玻璃匀浆器中, 再加人冷冻的PBS, 按脑组织重量与匀浆总体积1：10的比例, 稀释混匀。将制备好的 10%脑匀浆以 3000 r·min-1离心 15 min, 取上清置 -20℃保存待测。

1. 4 酶联免疫吸附法测定脑匀浆上清TNF-α 酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉中美科技有限公司 0133R)实验步骤严格按试剂盒说明书操作。

1. 5 脑梗死体积 72 h后假手术组随机取3只, 治疗组、模型组随机各取7只。将脑片浸入37℃的2%四氮唑红(TTC)染色10 min。正常组织染成深红色, 梗死灶呈白色。根据苍白区观察梗死灶范围。先用扫描仪将图像扫入LU ZEΧ2F 型图像分析仪分析测量脑梗死面积, 再按梯形法则计算脑梗死灶体积。

1. 7 统计学方法 计量资料结果以均数±标准差(x-±s)表示, 组间比较采用t检验/方差分析；方差不齐时采用秩和检验(Keuskal-Wallis法等)。计数资料组间比较采用χ2检验。（P＜0.05）表示差异有统计学意义, 采用SPSS13.0统计软件完成。

2 结果

2. 1 各组神经功能缺损程度评分结果(表1) 脑梗死术后相同时间点比较 , 除术后 2 h 外 , 通腑组大鼠 LongaEZ 5 分制评分均低于模型组(P＜0.01)，差异有统计学意义。

表1 各组动物LongaEZ 5分制评分结果(±s)

表1 各组动物LongaEZ 5分制评分结果(±s)

注 ：△与模型组比较 , P＜0.01 ； ( )内为动物数 , 单位 :只

组别 术后2h 术后24 h 术后72 h 术后1 w TF组N.S.组1.74±0.45(19)1.85±0.45(18)2.18±0.50(19△)2.63±0.49(18)1.83±0.65(18)△2.35±0.49(16)1.31±0.47(9)△2.00±0.57(7)

2. 2 酶联免疫吸附法测定脑匀浆上清TNF-α 各组大鼠大脑皮层TNF-α检测结果(表2)。

表2 各组鼠脑匀浆中TNF-α水平(±s)

表2 各组鼠脑匀浆中TNF-α水平(±s)

注：TF 组：通腑干预组 , N.S.组：模型对照组 , Sham 组：假手术组。与 Sham 组比较 , *P＜0.05, **P＜0.05。

组别 C浓度(pg/ml)TF组(给通腑醒神组) 12575.64±3287.819*N.S.组(给生理盐水) 14290.03±4689.27**Sham组(给生理盐水) 7695.033±1481.749

各组脑组织中TNF-α浓度结果表明：大鼠脑组织损伤2w, 通腑组及模型组脑组织TNF-α表达仍高于假手术组, 具有显著性差异(P＜0.01)；但通腑组及模型组相比无明显差异(P＞0.05)。

2. 3 脑梗死情况(表3)

表3 两组大鼠脑梗死灶体积比较(mn3，±s)

表3 两组大鼠脑梗死灶体积比较(mn3，±s)

注 ：*与对照组比较 P＜ 0.01。

组别 n 组别鼠数脑梗死灶体积(mm3)TF组N.S.组77 134. 40±45. 257*192. 11±19. 53

TTC染色结果表明, 假手术组脑片均红染, 无白色梗死灶形成。再灌注72 h时, 通腑醒神干预组与模型对照组均有不同程度的白色梗死灶, 主要位于额顶部外侧皮质及纹状体。术后72 h通腑组的脑梗死体积明显低于模型组, 两组相比具有明显差异(P＜0.01)。

3 讨论

脑缺血后的炎症反应一是以脑微血管内白细胞聚集穿过血管壁, 浸润脑组织, 伴有微血管功能紊乱及局部脑组织中液体及蛋白质积聚为标志的急性炎症过程；二是曾有研究证明脑缺血再灌注24h时血脑屏障被破坏最严重［4,5］因此抑制炎症因子的表达可作为防止脑缺血性疾病的新途径。实验中发现, 假手术组脑切片与模型对照组脑切片对比显示, 脑缺血再灌注损伤72 h后大鼠右脑出现大面积脑梗死现象；通腑醒神胶囊干预组脑切片与模型对照组脑切片对比显示, 通腑解毒法可以使MCAO模型SD大鼠脑缺血/再灌注损伤 72 h 脑梗死体积显著减小；降低造模后 24 h、72 h、1 w, 3个时间点大鼠神经功能缺损评分, 对缺血性神经细胞具有保护作用。

TNF-α是一种由细胞分泌的前炎性细胞因子, 参与机体的免疫应答和炎症反应。TNF-a是脑缺血损伤后最早出现的炎性细胞因子之一［6］。脑缺血/再灌注损伤2w时,脑组织中TNF-α表达仍高于正常, 提示脑缺血/再灌注损伤后炎症反应持续存在；提示中的TNF-α在脑缺血损伤作用表现为损伤和抗损伤的双重作用, 因此, 我们推测, 通腑解毒法对缺血性中风急性期脑损伤的治疗作用可能是通过抑制TNF-α等多种炎症介质的产生、释放,从而减轻或中断炎症级联反应、减少细胞凋亡达到保护神经细胞的目的, 从而对脑损伤起到治疗作用。为推广通腑解毒法在中风急性期的应用提供了实验依据。通腑解毒法可以明显改善脑缺血/再灌注损伤后炎症反应, 但有关TNF-α在脑缺血中保护与损伤作用机制有待于进一步研究与探讨。

［1］ 徐海清.脑缺血病灶炎症反应的意义.国外医学神经病学神经外科学分册 , 2002, 29(5):430-432.

［2］ 刘建辉, 冀凤云, 王婷, 等.三七总皂苷对脑缺血再灌注损伤脑保护作用的实验研究.中国临床神经科学, 2002, 10(1):90.

［3］ 杜力军, 周金黄, 邢东明.从中药新药研究对证动物模型的思考 .中国实验动物学杂志 , 2000, 10(1):23-26.

［4］ 张勇, 杨利生, 李缓.通腑法治疗出血性中风探讨.陕西中医,2005；26(2):140.

［5］ 陈苡靖.化痰通腑法治疗中风病急性期探讨.辽宁中医学院学报 , 2004, 6(6)44l-442.

［6］ O'Hara0, Yonekawa Y, Tanaka k, et a1.The role of brain— derived neurotrophlc factor in transient forebrain ischemia in rat brain.Neurosurgery， 1994,34:323.