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Aβ25-35寡聚体对大鼠海马神经细胞的活性影响及形态学观察

2013-09-20黄昕艳赵锦程尉荣翠朱晓峰

中风与神经疾病杂志 2013年3期
关键词:原代神经细胞海马

黄昕艳, 赵锦程, 尉荣翠, 杨 智, 刘 爽, 朱晓峰

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种慢性进行性神经退变性病变,其典型的临床病理学改变为β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)沉积、神经元纤维缠结和神经元缺失[1]。Aβ是老年斑的核心成分,在AD的发生、发展过程中起关键作用,本实验旨在通过Aβ25-35寡聚体诱导海马神经元细胞损伤来探讨其活性及形态学指标的变化,筛选Aβ25-35寡聚体致伤条件下适宜的AD细胞模型。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物:新生 Wistar大鼠(1~3d),由佳木斯大学实验动物中心提供。(2)主要试剂:DMEM/F12干粉培养基、B27、Neurobasal-A培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(购于美国Gibco公司);Aβ25-35、二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、HFIP(六氟丙醇)购于武汉博士德公司;兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)单克隆抗体、SABC即用型试剂盒、DAB显色试剂盒(购于Boster公司);青霉素、链霉素(华北制药股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代海马神经元培养 出生1~3d内的Wistar大鼠,无菌条件下断头,在冰浴的D-hank s液中取脑并分离出双侧海马组织,剪切成约1mm×1mm×1mm的组织块,0.125%胰酶37℃消化约20min。用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中终止消化,用口径光滑的小吸管反复吹打分散,200目细胞筛过滤后,1000r/min,离心5min,弃掉上清液,加入培养基重悬,制成(2~3)×105个/ml密度的细胞悬液,接种于预先用0.1mg/ml多聚赖氨酸包被的96、24、6孔板中。置于37℃、5%CO2培养箱内培养,24h后换成Neurobasl+B27(2%)培养基,以后每3d换液1次。

1.2.2 神经元鉴定 培养至7d的神经细胞,以PBS轻洗3遍,4%多聚甲醛固定30min后,PBS洗2次。0.4%TritonX-100破膜 20min,PBS洗 3遍,山羊血清封闭30min,滴加NSE(1∶200稀释)一抗,4℃湿盒内孵育过夜。次日PBS洗3遍,加二抗室温避光孵育50min,PBS洗3遍;加新鲜配制的DAB溶液显色,待显色充分后,加入三蒸水终止反应,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光镜观察,(PBS代替一抗做阴性对照)。

1.2.3 实验分组 将原代培养8d后的神经元随机分为5组:正常对照组、损伤组,加入终浓度分别为 1.0、5.0、10.0、20.0μmol/L 的 Aβ25-35寡聚体,Aβ25-35寡聚体的制备参考王建秀等文献[2],继续培养24h。

1.2.4 神经细胞形态学观察和定量分析Aβ25-35寡聚体孵育24h后,于倒置显微镜下观察其存活情况和形态,随机选取30个视野,记录每个视野内有突起的细胞数和突起总数,同时目镜微尺测量突起的长度,重复3次。

1.2.5 MTT法检测细胞活性 采用MTT比色法检测培养细胞的存活率。按上述分组处理24h后,向96孔板中各组细胞分别加入 5mg/ml MTT20μl,37℃继续培养4h后弃上清液,每孔加入150μl DMSO,振荡10min,待紫色结晶完全溶解后,用酶标仪检测各组细胞570nm吸光度值(opti-cal density,OD)。每个浓度设5个复孔,计算其平均值,同时设不加细胞的空白孔。根据公式计算:细胞存活率(%)=处理组细胞OD值/对照组细胞OD值×100%。

2 结果

2.1 神经元形态学观察及鉴定 接种后的海马神经细胞呈圆形,单个均匀分布,2h后开始贴壁,培养24h后细胞大部贴壁且部分已长出突起。随培养时间延长,突起逐渐增多、延长并交织成网。胞体呈多角形或椭圆形,周围有光晕,胞体体积较大,透光性强,核大;培养至7d的细胞胞体饱满、有立体感;突起明显增多、增长、交织成网、细胞生长成熟。与阴性对照、阳性对照比较,NSE免疫染色显示95%以上的培养细胞为阳性染色,符合细胞原代培养纯度要求(见图1)。

图1 神经细胞原代培养(×100)

Aβ致伤模型组可见到部分神经细胞出现胞体缩小,细胞周围晕光不强;细胞突起消失或明显减少、缩短,细胞碎片增多,甚至细胞崩解,神经细胞数目下降等变化。Aβ1.0μmol/L组神经细胞形态基本正常,贴壁良好、突起较长,可相互连接成网络。Aβ5.0μmol/L组神经细胞生长状态不如正常对照组旺盛,神经元突起数目、长度与正常对照组相比有明显的差异(P <0.05,P <0.01)。Aβ10.0μmol/L组神经细胞存活状态欠佳,突起变短,有较多的圆形及浮细胞,其突起的细胞数、神经元突起数目、长度与正常对照组相比有显著的差异(P<0.05,P<0.01,P < 0.01)。Aβ20.0μmol/L 组神经细胞生长较差,多数细胞突起变短、消失,细胞碎片较多。其突起的细胞数、神经元突起数目、长度与正常对照组相比有显著的差异(P <0.01,P <0.01,P <0.01),见图2、表1。

2.2 Aβ25-35寡聚体诱导损伤后神经细胞存活的影响 MTT测定结果显示,Aβ25-35寡聚体可导致神经细胞抑制,且神经细胞抑制表现为与Aβ寡聚体浓度依赖性关系,即随着Aβ寡聚体浓度增加神经细胞,存活率逐渐下降,其中20μmol/L组最明显,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);Aβ25-35寡聚体毒性会导致细胞损伤(见图2)。

图2 Aβ不同致伤浓度对原代培养神经细胞的影响(倒置显微镜,×100)

表1 Aβ25-35对神经细胞形态学改变的影响(χ ± s,n=30)

表2 不同浓度Aβ肽对海马神经元的影响(±s)

表2 不同浓度Aβ肽对海马神经元的影响(±s)

与空白对照组比较*P <0.05,**P <0.01

组别Aβ肽浓度(μmol/L)MTT吸光度(n=6)存活率(%)正常组模型组 1.0 5.0 10.0 20.0 1.23 ±0.05 1.19 ±0.04 0.96 ±0.06 0.87 ±0.05*0.62 ±0.03**98.24 ±2.17 89.86 ±3.23 75.95 ±2.05 58.86 ±3.11

3 讨论

Aβ级联学说的提出源自对AD的神经病理特征的发现,已经确认老年斑的主要构成物质是β淀粉样物质,Aβ在脑内异常聚集引起神经毒性,包括直接毒性和增强、放大各种伤害性毒性,导致神经细胞死亡[3]。

目前认为,Aβ在大脑皮质内的蓄积是AD病理发生过程中的一个早期必然事件[4],研究表明,Aβ在形成纤维性沉积前的中间体状态,即Aβ寡聚体亦可产生神经毒性作用。动物实验研究表明,Aβ寡聚体可以在生理水平明显抑制大鼠海马的突触传递[5]。且发现在AD发病早期还未出现明显的老年斑之前,其认知功能的减退与可溶性Aβ水平及突触功能障碍密切相关[6,7]。因此,建立良好而稳定的AD突触损伤模型对探索AD早期记忆损害事件的成因及AD发病机制的研究非常重要。

Aβ肽全长的第25~35个氨基酸残基是Aβ的非生理性最小毒性片段,故本实验以Aβ25-35寡聚体致伤与记忆密切相关的海马神经元为研究对象,来筛选适宜的AD突触损伤模型,为AD早期的防治探求的有效的途径。

Aβ25-35寡聚体致伤 24h后从形态学观察,Aβ25-35寡聚体可致神经细胞损伤,且神经细胞毒性表现与 Aβ25-35寡聚体呈剂量依赖性关系,其中Aβ25-3520μmol/L组致伤显著,细胞存活状态差,有部分细胞脱壁,细胞间网络消失,细胞外基质杂乱,其突起的细胞数、神经元突起数目、长度与正常对照组相比有显著的差异(P<0.01);不适宜作为AD突触损伤模型进行下一步研究。

Aβ25-3510μmol/L组突起的细胞数、神经元突起数目与Aβ25-3520μmol/L组相比有所改善,突起的细胞数与正常对照组相比有一定差异(P<0.05),但神经元突起数及突起的长度与正常对照组相比仍有显著的差异(P<0.01),大部分神经细胞突起已丧失,故也不宜作为适宜的突触损伤模型。

Aβ25-355μmol/L组细胞生存状态尚可,突起的细胞数与正常对照组比照差异不显著,神经元突起数目与正常对照组相比(P<0.05),突起的长度与正常对照组相比有显著的差异(P<0.01),损伤模型中神经细胞数量尚稳定,神经元突起数目有部分损失,但尚可作为Aβ致突触损伤模型做进一步研究。

对于Aβ25-351μmol/L组细胞损伤效果不明显,神经元突起数、突起长度与正常对照组比较差异不显著,不宜作为有效的突触损伤模型。

在MTT测定结果显示 Aβ25-3510μmol/L组与Aβ25-3520μmol/L组细胞存活率降低较明显,不适宜作为AD的突触损伤模型,同样支持上述结果。

本实验以Aβ25-35寡聚体致伤海马神经细胞,筛选出5μmol/L为适宜的AD突触损伤模型的致伤浓度,希望为AD早期的防治探索更有效的途径。

[1]Pereira C,Ferreiro E,Cardoso SM,etal.Cell degeneration induced by amyloid-beta peptides:implications for Alzheimer’s disease[J].Mol Neurosci,2004,23(1):97-104.

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