油菜种皮色素的研究进展

唐志东，鲁军雄，袁玉辉

(湖南农业大学/国家油料改良中心湖南分中心，长沙410128)

菜籽颜色由种皮中色素物质的组成决定，同时色素物质也作为信号分子和植物抗菌素参与逆境胁迫、种子休眠等生理过程［1］。研究种皮中主要色素物质对种皮颜色的影响和测量方法有助于了解种皮颜色的形成机理，在理论研究与育种实践上具有重要意义。

1 油菜种皮化学组成

油菜种皮成分复杂，含有水、蛋白质、糖类、矿物质、纤维素、木质素、色素等。相同的油菜品种，由于地区、土壤、气候、生产条件、收获时间的差异，造成其种皮中相关成分的含量各不相同。Naczk等［2］分析了甘蓝型油菜种皮主要成分，发现含油量为5.5±0.1%，蛋白质含量为15.1±0.1%，灰分含量为5.2±0.1%，食用纤维含量为66.3±0.8%。刘运荣等［3］对油菜种皮中主要成分含量进行测定，发现油菜种皮的水、蛋白质、油、不溶性膳食纤维、单宁含量分别为 10.08%、10.20%、5.15%、46.60%、3.00%。

油菜种皮中色素物质包括叶绿素、叶黄素、多酚、类黄酮、花色素和黑色素等［4］。

在芸薹属作物种子中，类黄酮物质主要有山奈酚衍生物、槲皮素衍生物、异鼠李素衍生物、表儿茶素糖苷［5］。油菜种皮中的类黄酮主要包括黄酮醇、原花青素(PCs，表儿茶素低聚物)、(－)－表儿茶素等，其黄酮醇主要为山奈酚、槲皮素和异鼠李素的衍生物［6，7］(表 1)。不溶性的原花色素(PAs，也称作缩合丹宁)在成熟种子的种皮中大量积累，是一类由黄烷3－醇的聚合物与蛋白质、多糖等大分子结合的产物。油菜黄、黑籽种皮中都不含花青苷［8］。

图1 油菜种皮中主要类黄酮的结构式

表1 油菜种皮中主要类黄酮［7～9］

油菜种皮黑色素的化学结构和合成途径一直没有定论。植物黑色素大部分是由黄烷3－醇、黄烷3，4－二醇等酚类物质经过多酚氧化酶催化后形成的邻苯醌。这些邻苯醌本来没有太深的颜色，但因其拥有大量的助色团酚羟基，而使颜色迅速加深。叶小利等［4］用高效液相色谱(HPLC)分析了甘蓝型黄、黑籽油菜种皮黑色素的组成，发现黄、黑籽种皮黑色素组成相同，为吲哚型和邻苯二酚型组成的混合黑色素，这种黑色素以游离酪氨酸和多酚为前体合成，可见，酚羟基酶在多酚转换为黑色素的过程中起到了重要作用。

2 油菜种皮中色素物质对颜色的影响

不同颜色油菜种皮中相关色素物质存在差异。曾盔等［10，11］发现，芥菜型黄籽种皮的多酚含量为黑籽种皮的70%，而甘蓝型黄籽种皮中的多酚仅为黑子种皮的10%。Lipsa等［12］测定了166个DH群体黄、黑籽油菜种皮中的总黄酮含量，发现油菜种皮颜色与总黄酮含量的相关性非常低，说明类黄酮对油菜种皮颜色没有直接的影响。叶小利等［13］研究结果显示，甘蓝型黄、黑籽油菜种皮中的多酚、类黄酮、花色素、黑色素达到极显著差异，在种子发育的初、中期，多酚、类黄酮、花色素是影响种皮色泽差异的主要因素，在种子发育后期，黑色素是影响种皮色泽的主要因素。梁颖等［14］研究了甘蓝型油菜种皮中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、谷氨酰胺合成酶(GS)的差异，发现相同遗传背景下，黑籽油菜种皮中PAL和PPO的含量高于黄籽种皮，GS的含量则没有显著的差异。Lepiniec等［6］用高效液相色谱(HPLC)测定种皮中的PAs，发现黄籽种皮中不含表儿茶素。Marles等发现甘蓝型油菜黑籽种皮中木质素含量明显高于黄籽种皮，黑籽种皮中PAs含量最高可达到10 mg/g，而存在黑色斑点的黄籽油菜种皮中才含有微量的 PAs［8］。Routaboul等［15］发现，油菜种皮中的PAs首先是以无色的形式存在，然而在种子干燥过程中其颜色逐渐变深。Auger等［7］认为在种子发育后期，种皮中的PAs有一个被氧化的过程，被氧化的PAs很难被提取出来，并且导致种皮颜色变深，这与种皮颜色的变化过程相吻合。在野生型的拟南芥种皮中，PAs为主要的色素，其包括了原矢车菊素和槲皮素等衍生物，PAs被氧化后造成种皮颜色的改变。拟南芥tt突变体种皮中的色素主要为黄酮醇类物质，这导致了种子的外观为黄色［16］。这些研究都说明，PAs这种类黄酮才是种皮颜色形成的决定性物质，而其他物质(木质素、黄酮醇等)对种皮颜色的形成可能只起辅助作用。

3 油菜种皮类黄酮的检测方法

3.1 定量检测方法

有机溶剂提取是提取类黄酮主要的方法，甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚等都可以提取类黄酮。乙醇和甲醇是使用最多的两种提取物，苷元类物质适合用高浓度的醇(90% ～95%)提取，苷类物质适合用60%左右的醇提取［17］。Auger等［7］用甲醇/丙酮/水/TFA(40∶32∶28∶0.05，v/v/v/v)提取甘蓝型油菜种皮中的类黄酮。Routaboul等［18，19］用乙腈/水(75∶25，v/v)提取拟南芥种皮类黄酮。超声波辅助提取法、微波辅助提取法的运用能显著提高黄酮类物质的提取效率［20，21］。

分光光度法是测定总黄酮含量的主要方法。以芦丁为标准品，利用类黄酮的3－或5－OH及邻二酚羟基能与Al3+络合，在加入NaOH后即生产红色物质，于510 nm处测定其吸光度并计算出类黄酮含量。万华方等［22］用5%的HCl－甲醇溶液提取油菜种皮可溶性色素，分别在600 nm、530 nm(花色素)、325 nm(类黄酮)、280 nm(多酚)波长测定吸光度，通过换算得到花色素、类黄酮、多酚的含量，最后再向残渣中加入2%NaOH提取黑色素，于290 nm处测定其吸光度并计算出黑色素含量。

PAs是油菜种皮主要的类黄酮，在酸性条件下PAs的化学活性较高，其上的间苯三酚和间苯二酚可与香草醛发生缩合，并在浓酸条件下形成有色的碳正离子，测其吸光度，根据标准曲线可以计算出样品中的 PAs含量［23］。甘蓝型黑籽油菜种皮中的PAs含量达到19.13～62.13 mg/g，其中不能溶解的PAs占总 PAs的70% ～ 95.8%［24］，不同的提取方法和不同的材料都可以导致测量结果的差异。

表2 不同方法提取油菜种皮中PAs结果

3.2 定性检测方法

3.2.1 紫外光谱法

各类黄酮都含有特征的紫外吸收光谱，不同的类黄酮由于分子中共轭体系和羟基数目、位置和存在形式的不同，导致其紫外－可见吸收光谱发生有规律的变化。类黄酮在醋酸钠、三氯化铝、氢氧化钠、三氯化铝/盐酸、硼酸/醋酸钠等试剂的作用下，紫外光谱吸收带的变化与结构有一定关系，目前已有大量的数据、规律可供参考［29，30］。曾盔等［11］根据种皮提取液的紫外－可见光谱结果进行综合分析、比对，推测出种皮中的黄酮类多酚含有黄烷酮(醇)类分子，根据位移试剂导致的谱带蓝移和红移得出黑籽种皮中含C环有3－OH的黄烷醇类分子，黄籽种皮含A环有单酚羟基的黄酮醇类分子。

3.2.2 质谱(MS)法

MS对油菜种皮中类黄酮进行结构解析，可以获得化合物的分子量、分子式和特征碎片等信息。Auger等［7］利用 LC－ESI－MSn技术细致分析了甘蓝型油菜种皮中类黄酮的含量与组成。提取的可溶性类黄酮首先在m/z200到m/z2000的范围扫描，鉴定出主要的类黄酮。然后用ESI－MSn并结合碰撞诱导裂解(CID)谱对其进行分析后得出种皮类黄酮的裂解特征。为了得到实际质量的离子，飞行时间型(TOF)质谱结合电喷雾电离(ESI)以及高效液相色谱(HPLC)被用来进行综合的分析。研究结果显示出甘蓝型油菜种皮中的PAs是由(－)－表儿茶素组成的聚合物，5种原花青素(PCs)和7种黄酮醇被发现。Routaboul等［15］用 HPLC－ESI－MSMS技术对拟南芥种子中的类黄酮提取物研究，发现了26种黄酮醇物质，其中槲皮素3－O－鼠李糖苷是最主要的成分。用野生型拟南芥与11种tt突变体的测定结果进行比对后发现，它们的类黄酮含量和种类各不相同，不同的基因型导致了不同的类黄酮含量。

3.2.3 核磁共振(NMR)法

1H NMR和13C NMR是鉴定黄酮化合物的结构类型、确定取代基的位置和进行结构研究的有效办法。1H NMR的一般步骤为:首先，应用化学位移的知识，结合谱峰面积确定的氢原子数目，确定化合物中氢官能团的种类、结构;其次，应用n+1规律或二级偶合裂分，确定分子中基团和基团间的关系;再次，计算偶合常数，确定分子的构像或立体构型。13C NMR一般是在1H NMR谱解析的基础上开展的，对13C NMR的综合分析可以得到化合物分子结构所含碳原子的个数、化合物分子结构中各种可能的含碳官能团、化合物的结构骨架。Kerhoas等［19］运用MS与NMR对拟南芥种皮中的黄酮苷进行研究，鉴定出了槲皮素3－O－α－吡喃鼠李糖苷，山奈酚3－O－α－吡喃鼠李糖苷等3种黄酮苷物质以及其化学结构。

3.2.4 类黄酮物质的立体化学分析

许多类黄酮都含有不对称的碳原子，这使得类黄酮化合物有不同的绝对构型。目前，测定其化合物绝对构型的方法有圆二色光谱法。当平面偏振光通过含有生色团的光学活性物质时，其左、右圆偏振光的吸收值不同，造成通过的左、右圆偏振光速度与振幅不同，使叠加产生的偏振光将不再是平面偏振光，而是椭圆偏振光，通过这种椭圆率就可以得到圆二色谱(CD)，此法是测定类黄酮绝对构型的最常用方法［31］。另外还有晶体X射线衍射法。X射线是一种波长为0.001～50 nm的电磁波，当X射线照射到晶体上时，晶体周围会产生周期变化的电磁场，随之使原子中的电子发生周期性振动。因此，每一个原子都是散射X射线的中心，这些散射波的相干产生了一副衍射图像，从衍射图中可以得到分子的结构信息。此方法可靠性高，但一般要求被测物可形成良好的晶型，而且测定费用高［32］。此外，化学转化法、旋光法等方法也可用来分析油菜种皮中类黄酮物质的立体构型。

3.2.5 组织化学分析法

甲苯胺蓝(TBO)是一种多色性碱性染料，TBO可使细胞中的不同成分染成不同的颜色［33］。将成熟种子置于水中吸胀30 min，在放入树脂包埋试剂盒之前，用5%戊二醛(v/v)水溶液固定。用薄片切片机切出2 mm厚的切片，再将切片浸泡在TBO溶液中，TBO将果胶纤维素染成粉红色，将多酚类物质染成蓝绿色［34］。曲存民［9］对甘蓝型油菜种子的TBO染色切片观察后发现，授粉后14 d，黄、黑籽种脐部位均有PAs类多酚物质积累;授粉后21 d，黑籽种皮中PAs类多酚物质显著增多，黄籽的变化不大;授粉后28 d，黄、黑籽种皮色素层均有大量色素积累，但色素的种类存在很大差异，黑籽中主要积累的是PAs;授粉后35 d，种皮栅栏层中色素物质大量积累，黑籽种皮色素层的PAs明显多于黄籽;授粉后42 d和49 d，种皮中色素物质的积累没有明显增加。

DMACA组织化学染色法是黄烷3－醇和PAs的特定检测方法。将种子或者脱蜡的种子切片置于新鲜配制的0.3%(w/v)DMACA－无水乙醇/12 mol HCl(1/1，v/v)溶液中浸泡1 h，然后用70%乙醇漂洗，通过显微镜、肉眼的观察，被染成蓝色的部位含有 PAs［35］。Auger等［7］用 DMACA 组织化学分析法对甘蓝型油菜种皮中PAs的存在部位做了分析，发现授粉后的25 d，PAs就开始积累在种皮的色素层和种脐部位，成熟种皮中存在大量的PAs，而种胚中却没有。

二苯氨基苯基硼酸(DPBA)能与黄酮醇形成共轭产物，不同的共轭产物在紫外灯的激发下发出特殊的荧光。Auger等［7］根据这一原理，对甘蓝型油菜种皮中的黄酮醇物质进行观察，发现种皮类黄酮提取物反应后有微弱的橘黄色荧光;种胚的提取物表现出绿色的荧光;种子的提取物为橘黄色的荧光，对比山奈酚衍生物、槲皮素衍生物、异鼠李素衍生物分别与DPBA显色后的结果，发现种子、种皮中主要含有槲皮素衍生物，而种胚中主要含有山奈酚衍生物。这与拟南芥种皮中的观测结果是一致的［36］。

PAs在酸性条件下，其单体儿茶素A环的活性增加，A环上的羟基可与香草醛发生缩合反应，生成有色物质［35］。陆赢等［37］利用这一原理，对黄、黑籽油菜种皮分别进行染色，发现黄籽种皮不能被染色，而黑籽种皮授粉后15 d即可染成特异性红色。

4 结论和展望

油菜种皮中色素物质很多，而PAs决定其颜色。在甘蓝型、白菜型油菜中，PAs的合成已经有了比较清晰的研究，而芥菜型油菜的相关研究还未见报道。黄酮醇在油菜中可能有重要的生理作用，目前已育成的黄籽品种大多农艺性状和抗性较差，这可能与黄酮醇物质的改变有关。有针对性地改变种皮中类黄酮而不影响油菜植株中该物质的含量，可以在不影响油菜正常生理的条件下改变油菜籽种皮颜色。但是这需要分别对黄、黑籽油菜种皮中色素物质的差别进行更加细致的研究。

模式植物拟南芥的种皮颜色调控机制和油菜种皮具有高度的保守性，能给研究人员大量的启发。将来，黄色油菜种皮基因的精细定位、不同颜色油菜种皮色素的种类和结构差异分析将对黄籽油菜的育种起到促进作用。

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