益生菌发酵豆乳中营养成分变化研究

吴 琼 于寒松，2 张 岚 刘俊梅，2 王玉华，2 常 鑫 胡耀辉，2

(吉林农业大学食品科学与工程学院1，长春 130118)

(国家大豆产业技术研发中心加工研究室2，长春 130118)

(吉林医药学院3，吉林 132000)

豆乳是人类重要的植物蛋白资源，富含优质蛋白［1］。由于大豆蛋白的氨基酸谱与人类的需求密切相关，因此它比任何一种植物蛋白对人体都有益［2］。益生菌是指投入后通过改善宿主肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主(人和动物)健康水平和健康佳态的活菌制剂及其代谢产物。目前，最常见的益生菌基本都属于乳酸菌和两歧双岐杆菌菌属［3－4］。

由于植物乳杆菌产生蛋白酶、有机酸等物质，不仅可将大豆中蛋白质、膳食纤维、低聚糖等大分子物质分解成小分子，将一些不溶性大分子化合物分解成可溶性小分子化合物，实现所谓的预消化作用，从而有利于促进蛋白质的消化吸收，而且使钙转化成乳酸钙，成为可溶性盐，从而大大的提高了钙的吸收率［5－7］。两歧双岐杆菌是人体内主要的双岐杆菌之一［8］，是自然栖居在人体肠道中的有益菌株，其主要作用有抑制有害菌群、维持肠道菌群平衡和保护肠道;代谢中产生有机酸、促进肠道蠕动、腹泻便秘双重调节［9］。因此，利用益生菌发酵豆乳可显著增加大豆制品的营养价值。

目前，未见针对植物乳杆菌和两歧双岐杆菌混合菌种发酵豆乳的报道，本试验将对植物乳杆菌、双岐杆菌、混合菌种发酵前后豆乳营养成分变化进行比较分析，以期为发酵豆乳研究奠定良好的试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大豆:市售。两歧双岐杆菌、植物乳杆菌:本研究室自用保藏菌种。

硫酸、硼酸、盐酸、甲基红、硫酸铜、溴甲酚绿、碳酸氢钠、氢氧化钠、磷酸二氢钾等。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器

SW－CJ－1F超净工作台:苏州安泰空气技术有限公司;DHP120恒温培养箱:上海实验仪器厂有限公司;LDZX－50KBS立式电热压力蒸气锅:上海申安医疗器械厂;infinitieM200酶标仪:NanoQuant;TL－18M高速台式离心机:上海离心机研究所;UV－2600型紫外可见分光光度计:尤尼柯(上海)有限公司;L－8800氨基酸自动分析仪:日本日立。

1.3 方法

1.3.1 豆乳的制作工艺

挑选大豆→脱皮→浸泡→磨浆→胶体磨→带渣煮浆→过滤→分装→灭菌→冷却→成品

1.3.2 发酵豆乳的制备

按1.3.1制作豆乳，其中分别接入植物乳杆菌、两歧双岐杆菌和混合菌种。接种量均为10%，混合菌种比例为植物乳杆菌∶两歧双岐杆菌 =1∶1，于37℃发酵。发酵后将豆乳在－45℃条件下真空冷冻干燥，待用。

1.3.3 发酵豆乳中蛋白质含量的测定

凯氏定氮法［10］。

1.3.4 发酵豆乳中蛋白质分子量的测定

SDS－PAGE凝胶电泳。浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为 12%［11］。

1.3.5 发酵豆乳中小肽含量的测定

75%乙醇沉降法［12］。

1.3.6 发酵豆乳中氨基酸含量的测定

采用氨基酸自动分析仪［13］。

1.4 数据处理

平均值和标准差由3个样品的测量结果经计算得到，数据处理与分析采用SPSS 12.0软件进行方差分析，并且应用Excel进行常规数据处理。。

2 结果与分析

2.1 发酵豆乳可溶性蛋白质含量比较

采用两歧双岐杆菌和植物乳杆菌对豆乳进行单菌种和复合菌种发酵后，样品中蛋白质含量如图1。

图1 发酵豆乳蛋白质含量变化

植物乳杆菌、双岐杆菌7～12 h为菌种生长对数期，因此单菌种发酵采用7～12 h进行测定，混合菌种在5～12 h菌体活力最强，因此选择5～12 h进行测定。由图1可知在发酵过程中豆乳本身氮元素含量没有发生变化，因此单菌种和混合菌种发酵时蛋白质含量随着发酵时间的延长，基本没有变化。但接入菌种后由于菌体中含有蛋白质，导致豆乳中引入了新的氮元素，因此，在接入菌种初期豆乳蛋白质含量增加，之后保持平稳状态。

2.2 发酵豆乳蛋白质分子质量分布比较

发酵豆乳中蛋白质分子质量分布分析结果见图2～图4。

由图2～图4蛋白质电泳图谱可见，未发酵的豆乳蛋白有8条蛋白条带，分子质量分别为200、80、70、40、35、30、20、14 ku;植物乳杆菌与两歧双岐杆菌混合发酵12 h后，豆乳中仅剩5条蛋白条带，分子质量分别为 35、30、20、14、6.5 ku。由于在发酵过程中产生一系列蛋白酶，将大分子蛋白降解为小分子蛋白，与未发酵豆乳比较，分子质量为200和80 ku的蛋白质明显降解，在12 h之后几乎消失，由于大分子蛋白的降解，蛋白分子质量35 ku左右的条带加粗，表明35 ku分子质量蛋白质有所增加，且小分子质量条带表达稍有增加;两歧双岐杆菌与混合菌种发酵豆乳变化趋势基本相似，发酵12 h后有6条蛋白条带，蛋白质分子质量分别为 35、30、25、23、20、15 ku，由于两歧双岐杆菌发酵也产生一定量的蛋白酶，因此，小分子质量的蛋白条带有所增加。植物乳杆菌发酵豆乳12 h后，有5条蛋白条带，蛋白分子质量分别为35、30、25、20、15 ku。蛋白分子质量为 200 和80 ku左右的条带经发酵后明显降解，35 ku左右的条带出现微弱的降解，且小分子质量条带稍有增加。由此可以推测，发酵后大分子蛋白经蛋白酶降解为小分子蛋白。

2.3 发酵豆乳小肽含量比较

采用两歧双岐杆菌和植物乳杆菌进行单菌种和复合菌种制备发酵豆乳中小肽分析结果见图5。

图5 发酵豆乳小肽含量变化

由图5可知，植物乳杆菌、两歧双岐杆菌和混合菌种发酵豆乳过程中小肽含量随着发酵时间延长逐渐增加，小肽含量最高出现在10 h，小肽含量分别比未发酵豆浆增加了19.4%、22.16%和27.12%，通过SPSS 12.0软件分析后，混合菌种、植物乳杆菌和两歧双岐杆菌发酵豆乳发酵中小肽含量最大值与未发酵豆乳中小肽含量均差异极显著(P＜0.000);混合菌种发酵豆乳分别与植物乳杆菌和双岐杆菌发酵豆乳进行比较，小肽含量最大值与两者均差异极显著(P＜0.000)，植物乳杆菌和双岐杆菌发酵豆乳比较，两者小肽含量最大值差异不显著(P＞0.1)。

2.4 两歧双岐杆菌和植物乳杆菌单菌种发酵与混合发酵豆乳氨基酸含量比较

采用两歧双岐杆菌和植物乳杆菌对豆乳进行单菌种和复合菌种发酵后，分析样品中天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸等16种氨基酸，其中变化明显的氨基酸结果见表1～表3。

由表1～表3可知，植物乳杆菌发酵豆乳时间为10 h时总氨基酸含量达到最高，与未发酵豆乳相比增加了8.22%。两歧双岐杆菌发酵豆乳时间为7 h时总氨基酸含量达到最高，与未发酵豆乳相比增加了10.61%。混合菌种发酵时间为12 h时总氨基酸含量达到最高。由于混合菌种发酵前期消耗的氨基酸较多，因此氨基酸含量有所偏低，当发酵时间12 h时氨基酸含量达到最高。与未发酵豆乳相比增加了9.95%。

表1 植物乳酸发酵豆乳氨基酸变化/%

表2 双岐杆菌发酵豆乳氨基酸变化/%

表3 混合菌种发酵豆乳氨基酸的变化/%

3 讨论与结论

本研究菌种选取植物乳杆菌和两歧双岐杆菌作为发酵的菌株，由于两歧双岐杆菌可以抑制蜡样芽孢杆菌等腐败菌繁殖［14］，植物乳杆菌可以产生共轭亚油酸、低聚糖、蛋白酶、有机酸等有益人体生命活动的物质［15］，因此将两种菌株进行混合发酵豆乳，并且两者混合后可保证在4 h达到凝乳。本研究从蛋白质的含量、分子质量、小肽、氨基酸方面比较了植物乳杆菌、两歧双岐杆菌单菌种发酵和混合菌种发酵豆乳的变化。由于植物乳杆菌、双岐杆菌7～12 h为菌种生长对数期，因此单菌种发酵采用7～12 h进行测定，混合菌种在5～12 h菌体活力最强，因此选择5～12 h进行测定。

由于接入菌种后菌体中含有蛋白，导致豆乳在植物乳杆菌、两歧双岐杆菌、混合菌种发酵过程中蛋白质含量增加，随后蛋白质含量基本保持恒定。

未发酵豆乳蛋白有8条蛋白条带，由于在发酵过程中产生一定量的蛋白酶，这些蛋白酶将大分子蛋白质分解成小分子蛋白质，因此混合菌种发酵豆乳12 h后有5条蛋白条带，未发酵豆乳中分子质量为200和80 ku蛋白质经过发酵后明显降解，在12 h之后几乎消失;蛋白分子质量35 ku左右的条带出现加粗趋势，且小分子质量条带表达稍有增加。双岐杆菌与混合菌种发酵豆乳变化基本相似，发酵12 h后有6条蛋白条带，植物乳杆菌发酵豆乳12 h后，有5条蛋白条带。研究表明豆乳中呈现豆腥味的脂肪氧化酶分子质量为80 ku［16］，由于本文采用植物乳酸菌、两歧双岐杆菌单菌种和混合菌种发酵豆乳中蛋白分子质量为200和80 ku左右的条带经发酵后明显降解，因此豆腥味明显下降。这为益生菌发酵有助于减弱豆腥味的形成，改善发酵制品的风味提供了理论依据。此结果与杨媚［16］采用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵豆乳蛋白质分子质量80 ku左右条带明显降解，小分子质量条带表达稍有增加的结果相符，而本试验采用的双岐杆菌和植物乳杆菌发酵后大分子条带基本全部降解，说明降解蛋白质能力较高，发酵后的豆乳大分子蛋白变为小分子蛋白更易被人体吸收。

在植物乳杆菌、两歧双岐杆菌、混合菌发酵豆乳产生的蛋白酶作用下将蛋白质分解成小肽，使得小肽含量分别增加了19.4%、22.16%和27.12%。

发酵豆乳的氨基酸在种类上并没有增加，但是在含量上都有不同程度的变化，氨基酸总含量分别增加了9.95%、8.22%和 10.61%。与 Song 等［17］用双岐杆菌Bb12、酵母菌IFJ87发酵大豆粉中氨基酸总含量分别增加了0.74%、9.06%相比，本试验中植物乳杆菌和两歧双岐杆菌混合发酵后氨基酸总含量略高，各种氨基酸含量均不同程度增加。特别是缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸分别增加了8.02%、10.85%、8.15%。以上结果表明，益生菌发酵之后对豆乳大分子蛋白质起到了预消化作用，同时有效降低了豆乳的豆腥味，改善了豆乳的风味。

［1］王水泉，包艳，张延超，等.具有潜在益生特性的发酵乳杆菌在豆乳中的发酵特性［J］.中国乳品，2010，38(5):7－12

［2］苏芳.六株植物乳杆菌在豆乳中的发酵特性研究［D］.呼和浩特:内蒙古农业大学，2011

［3］高凤祥，张艳杰.益生菌混合菌种在发酵豆乳中的优化［J］.食品与生物技术学报，2012，31(4):443 －447

［4］姚国强，包艳，董喜梅，等.益生菌发酵豆乳降血脂作用的研究现状［J］.现代预防医学，2012，39(15):3798－3802

［5］董喜梅，包艳，张勇，等.国内外发酵豆乳研究发展现状［J］.大豆科学，2010，29(5):883 －887

［6］张青，王记成，魏爱彬，等.益生菌干酪乳杆菌zhang和双岐杆菌V9［J］.发酵豆乳的研究，2010(1):1－5

［7］赵丽丽.乳酸菌的分离鉴定及其在酸豆乳加工中的应用［D］.北京:北京工商大学，2009

［8］马永平.含质粒人两歧双岐杆菌的分离、质粒测序和生物信息学分析［D］.重庆:重庆医科大学，2005

［9］闫丽雅.六株益生菌在豆乳中的发酵特性研究［D］.呼和浩特:内蒙古农业大学，2011

［10］GB 5009.5—2010，食品安全国家标准食品中蛋白质的测定［S］

［11］Da Teng，Meiyun Gao，Yalin Yang，et al.Bio － modification of soybean meal with Bacillus subtilis or Aspergillus oryzae［J］.Biocatalysis and Agricultural Biotechnology，2012(1):32－38

［12］张翠凤，李小东，郝再彬，等.大豆肽的快速测定方法［J］.中国乳品工业，2004(8):38－40

［13］GB 5009.124—2003，食品中氨基酸的测定［S］

［14］魏升宁.益生菌豆乳产品的研制及微胶囊技术应用研究［D］.长春:吉林农业大学，2011

［15］刘勇.植物乳杆菌益生特性及产共轭亚油酸能力研究［D］.呼和浩特:内蒙古农业大学，2010

［16］杨媚.应用萌发大豆制备益生菌发酵豆乳的研究［D］.广州:华南理工大学，2011

［17］Song Y S，Frias J，Martinez－ Villaluenga C，et al.Immunoreactivity reduction of soybean meal by fermentation，effect on amino acid composition and antigenicity of commercial soy products［J］.Food Chemistry，2008，108(2):571 －581.