D101和AB-8树脂对湖州铁线莲总皂苷吸附能力的比较

卢莉娜， 赵伟春， 沈婵娟， 郭 伟

(浙江中医药大学，浙江杭州310053)

湖州铁线莲Clematis huchouensis Tomura，药名金剪刀，为双子叶植物药毛茛科植物湖州铁线莲的全草［1］，辛、咸、温，入肝、膀胱经［2］，别名河边威灵仙、吴兴铁线莲(《杭州药用植物名录》)。铁线莲属植物作为药用已有很长历史，我国中医临床和民间常用于利尿通淋、祛风止痛。自20世纪70年代开始，已开展对铁线莲及其同属近缘植物的化学成分研究，迄今为止，从中分离出三萜皂苷、木脂素、黄酮、香豆素、生物碱、酚性成分和糖酯等多种成分［3］。三萜皂苷类成分为齐墩果酸或常春藤皂苷元的衍生物，因其所结合的糖数目及种类不同而异，是铁线莲的主要化学成分，且含量丰富［4］，生物活性多样，几乎无毒副作用，在临床上具有广泛用途和良好疗效。现代研究表明具有明显的抗炎、护肝、抗肿瘤以及机体免疫调节等药理作用。国内、外学者对该属植物的药理作用进行了较多的实验研究，一些品种已经做成制剂用于临床治疗。

大孔吸附树脂在上世纪70年代末开始应用于中草药化学成分的提取分离，1979年中国医学科学院药物研究所植化室报道大孔树脂［5］可用于三棵针生物碱、赤芍苷、天麻苷、薄盖灵芝中尿嘧啶与尿嘧啶核苷的分离。它对糖类的吸附能力很差，对色素的吸附能力较强，对皂苷、黄酮亦有很强的吸附作用［6］。利用大孔吸附树脂的多孔结构和选择性吸附功能可从中药提取液中分离精制有效成分或有效部位，最大限度地去粗取精。根据桂双英等［7］、吴方晖等［8］研究发现，D101和 AB-8树脂是在分离皂苷类物质中使用率较高、效果较好的两种树脂。通过比较不同样品上样量下D101和AB-8两种大孔吸附树脂对总皂苷的吸附率和解析率，能够找出分离能力更好的树脂，为其进一步的临床应用和新药开发提供依据。

1 材料

1.1 原料

湖州铁线莲于2008年7月初采自浙江湖州，经浙江中医药大学药学院姚振生教授鉴定为中药湖州铁线莲 (吴兴铁线莲);D101大孔吸附树脂(天津农药股份有限公司)、AB-8大孔吸附树脂(天津市海光化工有限公司);齐墩果酸 (中国药品生物制品鉴定所)。

1.2 试剂

95%工业酒精;石油醚、冰醋酸、高氯酸、香草醛为分析纯。

1.3 仪器

TU1900双光束紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司);R502B旋转蒸发仪(上海生申科技有限公司);FZ102微型植物试样粉碎机 (天津市泰斯利仪器有限公司);恒温水浴锅 (金坛市大地自动化仪器厂);DZF—6050型真空干燥箱 (上海博讯实业有限公司)。

2 方法

2.1 湖州铁线莲的乙醇提取

新鲜的湖州铁线莲叶和茎，置于鼓风干燥箱中56℃恒温烘干至恒定质量，粉碎，取100 g粉末于圆底烧瓶中，以1∶5(kg/L)的比例加入石油醚，70℃回流脱脂2次，每次1 h，过滤后将残渣风干。向风干后的残渣中加入8倍量的80%乙醇，浸泡过夜，在85℃回流提取2次，每次1 h。用四层纱布过滤，合并3次回流所得药液，滤液浓缩至无醇味，再放入真空干燥箱中干燥至恒定质量，即得湖州铁线莲浸膏。称取2.843 g浸膏，加入蒸馏水定容至500 mL，配制成5.686 g/L的湖州铁线莲乙醇提取物样品溶液，备用。

2.2 湖州铁线莲总皂苷的测定

2.2.1 最大波长的选择 精密称取10.00 mg齐墩果酸对照品，用甲醇溶解定容至10 mL量瓶。分别吸取0.0、20.0μL溶液于10 mL的具塞试管中，真空干燥隔夜蒸干溶剂。分别加入0.2 mL 5%香草醛－冰醋酸 (新鲜配制)和0.8 mL高氯酸进行显色，70℃水浴加热15 min，取出后立即用流水冷却3 min，然后加入5 mL冰醋酸稀释，以空白溶液为参比溶液，摇匀后全波长扫描，得出齐墩果酸对照品的最大吸收波长。

2.2.2 皂苷标准曲线的绘制 精确量取0.0、20、40、60、80、100μL对照品溶液，蒸干溶剂后显色方法如上所述，以空白溶液为参比溶液，于最大吸收波长处测定其吸光度，绘制标准曲线。

2.2.3 湖州铁线莲总皂苷的测定方法 取湖州铁线莲乙醇提取物样品溶液1 mL和0 mL于10 mL具塞试管中，其中0 mL为空白溶液。根据2.2.1项的方法，于最大吸收波长处测定吸光度，根据标准曲线计算湖州铁线莲样品的皂苷的量。

2.3 D101和AB-8树脂对湖州铁线莲总皂苷吸附能力的比较研究

2.3.1 上样量对总皂苷吸附率的影响 1)吸附:取D101和AB-8树脂各5份，每份折合成干树脂1.0 g(其中1.9 g D101湿树脂烘干后为1.0 g D101干树脂;3.0 g AB-8湿树脂烘干后为1.0 g AB-8干树脂)于锥形瓶，加入湖州铁线莲乙醇提取物样品溶液各5、10、15、20、25 mL于10个锥形瓶中，密封瓶口，并置于摇床上120 r/min震荡，静止吸附20 h。用移液枪吸取经树脂吸附后的溶液用于测定皂苷的浓度。树脂用去离子水冲洗至无色后进行真空抽滤，备用。

2)吸附后溶液皂苷的测定:取一定体积的上述经树脂吸附后的溶液于10 mL的具塞试管中，其中0 mL为空白溶液。根据2.2.1项的方法，于最大吸收波长处测定吸光度，然后根据标准曲线计算湖州铁线莲样品的皂苷的量。

2.3.2 上样量和乙醇体积分数对总皂苷解析率的影响 采用两种方法对经静态吸附了湖州铁线莲乙醇提取物的D101和AB-8树脂进行解析。1)分步洗脱:取上述经静态吸附了湖州铁线莲乙醇提取物的D101和AB-8树脂各5份。分步加入体积分数为30%，50%，70%的乙醇溶液，用量依次对应为 5、10、15、20、25 mL，120 r/min震荡解析20 h。

2)一次性洗脱:取上述经静态吸附的D101和AB-8树脂各5份，去掉上层溶液。一次性加入50%，70%，95%的乙醇溶液，乙醇溶液的用量依次对应为5、10、15、20、25 mL，120 r/min震荡解析20 h。

2.3.3 上样量和乙醇体积分数对总皂苷提取率的影响 计算并比较D101和AB-8树脂对皂苷提取率。

3 结果与分析

3.1 皂苷标准曲线

经紫外分光光度计扫描，可见齐墩果酸在548 nm处有最大吸收峰。经拟合，齐墩果酸标准曲线在0.02～0.100 mg范围内，吸光度与齐墩果酸质量呈良好的线性关系，其回归方程为Y=0.114 5X+0.006 8，R=0.999 4。式中Y为齐墩果酸质量，X为吸光度。

3.2 上样量对总皂苷吸附能力的影响

3.2.1 不同上样量下D101和AB-8树脂对总皂苷吸附能力的比较 实验结果见图1、2。D101树脂和AB-8树脂对湖州铁线莲皂苷的吸附量随着上样量的增加而增加，而吸附率则随着上样量的增加而减少。AB-8树脂在不同上样量下对皂苷的吸附量都较D101树脂大，吸附效果较好。

图1 不同上样量下D101和AB-8树脂对皂苷吸附量的比较Fig.1 Comparison on the adsorption quantity of D101 and AB-8 resin on saponins in different sample volumes

图2 不同上样量下D101和AB-8树脂对皂苷吸附率的比较Fig.2 Comparison on the adsorption rate of D101 and AB-8 resin on saponins in different sam p le volumes

3.2.2 不同上样量下D101和AB-8树脂对乙醇分步洗脱总皂苷解析率的比较 在用低体积分数乙醇洗脱的情况下，D101和AB-8树脂对皂苷的解析能力差别不大，随着乙醇体积分数的升高，AB-8树脂的解析能力明显优于D101树脂 (如图3、图4和图5)。因此在一次性洗脱时仅选用AB-8树脂进行实验。

图3 D101和AB-8树脂30%乙醇洗脱解析率的比较Fig.3 Comparison on the resolution rate of D101 and AB-8 resin on saponins eluted with 30%ethanol

图5 D101和AB-8树脂50%乙醇洗脱解析率的比较Fig.5 Comparison on the resolution rate of D101 and AB-8 resin on saponins eluted with 50%ethanol

图6 D101和AB-8树脂70%乙醇洗脱解析率的比较Fig.6 Comparison on the resolution rate of D101 and AB-8 resin on saponins eluted with 70%ethanol

3.2.3 不同上样量下AB-8树脂对乙醇一次洗脱总皂苷解析率和提取率的比较 由图6、7可知，随着单位质量的树脂处理的样品量增大，相同体积分数乙醇对总皂苷的解析率和提取率均不断增大，当树脂的上样量比为1∶20时，解析率和提取率均达最大值。当树脂的上样量一定时，随着乙醇体积分数的提高，皂苷的解析率和提取率亦逐渐增大。由于当乙醇体积分数过大时一些吸附在树脂上的非极性成分很容易被洗脱下来，会降低皂苷的纯度，同时考虑到乙醇用量和后续工艺中浓缩的工作量，因此，筛选出皂苷静态吸附最佳提取条件为树脂的上样量比1∶20、乙醇体积分数70%。

图6 AB-8树脂静态吸附乙醇一次性洗脱解析率比较Fig.6 Comparison on the resolution rate of saponins statically adsorbed by AB-8 resin and disposable eluted with ethanol

图7 AB-8树脂静态吸附乙醇一次性洗脱提取率比较Fig.7 Comparison on the extraction rate of saponins statically adsorbed by AB-8 resin and disposab le eluted with ethanol

4 讨论

4.1 植物的乙醇提取物中含有皂苷、黄酮和色素等多种成分。目前，对铁线莲属植物皂苷类成分的研究报道比较多，其次为黄酮类成分［3］，木脂素类等成分的研究报道较少［9］。铁线莲属植物中威灵仙含原白头翁素及以常春藤皂苷元、表常春藤皂苷元和齐墩果酸为苷元的皂苷［10］。但湖州铁线莲属植物中皂苷的提取分离及其组成尚未见报道。国内外有关对湖州铁线莲中黄酮类化合物提取分离纯化工艺及生理活性的报道也不多。仅见浙江大学药学院利用高效液相色谱法比较了分别采自杭州和浙江湖州铁线莲8个组分的含有量差异［11］。

4.2 实验结果表明，D101树脂和AB-8树脂对皂苷均有极好的吸附能力，两者的解析率亦随着乙醇体积分数的提高而提高，其中AB-8树脂对湖州铁线莲乙醇提取物中皂苷的吸附能力和乙醇的解析能力均优于D101树脂。其原因可能是因为大孔吸附树脂是通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物，而AB-8树脂颗粒较细小，因而具有更大的比表面积，等量的树脂拥有更大的吸附量。因此，筛选了AB-8树脂对湖州铁线莲乙醇提取物进行吸附和解析，去除了湖州铁线莲乙醇提取物中不易被大孔树脂吸附的其它成分。但是，AB-8树脂对湖州铁线莲黄酮亦具有较好的吸附能力，如何将湖州铁线莲乙醇提取物中的皂苷进一步分离纯化出来还有待于进一步研究。

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