大孔吸附树脂分离纯化知母皂苷A3的研究

2013-09-17李志雄孙兆林陈明苍徐德生

中成药 2013年2期

李志雄，孙兆林，陈明苍，徐德生*，吴斌*

(1．上海中医药大学，上海201203;2．中国科学院上海药物研究所，上海201203)

知母是一种常用中药，具有清热泻火，生津润燥的功效，所含知母皂苷、多糖等成分是主要活性成分［1-9］，知母皂苷A3(结构式见图1)是知母皂苷中的主要成分之一。黄成钢等申请的专利表明，经药理试验知母皂苷A3可降低血糖和治疗Ⅱ型糖尿病，效果良好［10］;韩昌均等申请的专利也表明，知母皂苷A3在预防或治疗Ⅱ型糖尿病的效果优异而在预防Ⅰ型糖尿病上效果较差［11］;李素燕等研究表明知母皂苷 A3体内给药具有抗血栓的作用［12］。可见知母皂苷A3有较好的应用前景。当前有应用大孔吸附树脂来精制知母总皂苷的研究［13-14］，但知母皂苷A3未见用大孔吸附树脂来精制的报道，现多采用硅胶层析柱来分离，需要反复硅胶层析，并且得率低，操作烦琐，周期长。大孔吸附树脂具有理化性质稳定、吸附选择性独特，吸附效率高、不受无机盐存在的影响、易再生等优点，且制备的量较大，有机溶剂可以回收再利用，节约成本，保护环境。本实验筛选了8种大孔树脂，最后选定AB-8型用于分离纯化知母皂苷A3，采用HPLC法测定成品的含有量，结果3批提取物中知母皂苷A3的质量分数均达到了90%以上。该方法制备周期缩短，制备的量较大。

图1 知母皂苷A3结构式

1 仪器与材料

Waters 600高效液相色谱仪，Alltech 500蒸发光散射检测器，XS105型电子分析天平 (Max 140 g d=0.01 mg，METTLER TOLEDO)，SHZ-B水浴恒温振荡器 (上海跃进医疗器械厂)，玻璃色谱柱 (30 mm×400 mm)，大孔吸附树脂 (天津市海光化工有限公司，天津市南开大学化工厂)。

知母购自上海康桥药业有限公司，经上海药物研究所沈金贵老师鉴定为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎。知母皂苷A3对照品为上海药物研究所自制，纯度为98.5%。

2 方法与结果

2.1 TLC检识知母皂苷A3 吸附剂:硅胶G;展开剂:正丁醇-乙酸乙酯-水 (4∶1∶5)的下层液;显色剂:10%磷钼酸的乙醇溶液，100℃显色清晰;对照品:知母皂苷A3对照品自制 (纯度为98.5%)。

2.2 HPLC测定知母皂苷A3 参考相关文献［15］及实验室具体情况，采用如下色谱条件:RP C18色谱柱 (3.9 mm×150 mm，5μm);柱温20℃;流动相:水-乙腈 (55∶45)，体积流量1.0 mL/min;漂移管温度108℃;气体体积流量2.92 L/min。供试品溶液的制备:取样品适量加甲醇超声溶解，0.45μm微孔滤膜滤过。样品溶液的测定:精密吸取对照品溶液10μL、20μL，供试品溶液10μL，进样，测定，以外标两点法对数方程计算。

2.3 上柱液的制备用乙醇提取知母药材，回收乙醇，浓缩，使每1 mL相当于3 g药材，再加适量水，静置沉降24 h，离心分离。沉淀用少量甲醇溶解，用TLC检识知母皂苷A3，结果沉淀中检测不到知母皂苷A3，表明水沉能除去杂质而目标成分没有损失。将上清液用水饱和的正丁醇提取3次 (此时水液中基本无知母皂苷A3)，合并正丁醇液，用0.1 mol/L NaOH溶液洗涤2次，弃去碱液，回收正丁醇，残渣用水溶解，每1 mL相当于3 g药材 (知母皂苷A3的质量浓度为3.999 mg/mL)，备用。

2.4 树脂型号的选择取上述经过水沉、萃取除杂的上清液175 mL，8份，分别加入50 g(湿质量)已处理好的8种不同的树脂中，置具塞锥形瓶中，于SHZ-B型水浴恒温振荡器中振荡24 h(25℃)，滤出大孔树脂，滤液量取体积，测定知母皂苷A3的量，计算每种树脂的吸附量。滤出的大孔树脂装于色谱柱中，用足量乙醇洗脱，TLC检测至洗脱液中无知母皂苷A3，合并洗脱液后测定知母皂苷A3的量，以求各种不同型号树脂的饱和吸附量以及解吸率，选择吸附量大以及解吸效果好的的树脂。结果见表1。

表1 不同树脂对知母皂苷A3的吸附量 (n=3)

结果表明，AB-8树脂对知母皂苷A3的吸附量最大，最大吸附量为13.17 mg/g树脂，并且解吸率较高。故选用AB-8树脂来分离知母皂苷A3。

2.5 洗脱溶剂洗脱能力的考察取经水沉、萃取除杂的上清液200 mL(C=3.999 mg/mL)，加入酸碱已处理好的AB-8大孔树脂柱中 (树脂柱床体积160 mL)，以0.5 BV/h的吸附流速吸附后，分别用240 mL(1.5 BV)①水、②20%乙醇、③30%乙醇、④40%乙醇、⑤50%乙醇、⑥60%乙醇、⑦70%乙醇、⑧80%乙醇、⑨90%乙醇洗脱，洗脱速度为1.5 BV/h，分别收集洗脱液，用HPLC法测定每份中知母皂苷A3的量，并用TLC法检识每个流份中的各类知母皂苷成分。结果见表2。

表2 洗脱剂含乙醇量对知母皂苷A3的影响 (n=3)

以上结果表明，水对知母皂苷A3无洗脱作用，TLC检识也无知母皂苷A3和其它皂苷，故可用水除去一部分杂质。HPLC测定结果表明20%、30%、40%乙醇对知母皂苷A3的洗脱能力不大，但TLC可以检识到大量的其它知母皂苷。HPLC测定结果表明70%乙醇对知母皂苷A3有较强的洗脱能力，且TLC只能检识到少量的其它知母皂苷。因此，在分离知母皂苷A3时，先用水洗脱，以除去糖类杂质，弃去水溶液;再用40%乙醇洗脱，以除去其它一些知母皂苷，收集40%乙醇洗脱液;再用70%乙醇洗脱，将知母皂苷A3洗脱下来，收集70%乙醇洗脱液，主要含有知母皂苷A3。

2.6 洗脱溶剂用量的考察取经水沉、萃取除杂的上清液200 mL(C=3.999 mg/mL)，加入75 g已处理好的AB-8大孔树脂柱中 (树脂柱床体积160 mL)，以0.5 BV/h的吸附流速吸附后，用8 BV水洗到洗脱液无色，4 BV 40%乙醇洗脱，4 BV 70%乙醇洗脱，4 BV 90%乙醇洗脱，测定3种不同洗脱液中的知母皂苷A3的量，结果如表3。

结果表明，4 BV 40%乙醇洗脱的知母皂苷A3的量较少，而4 BV 70%乙醇能将94.8%的知母皂苷A3从树脂上洗脱下来。

2.7 知母皂苷A3的精制 70%乙醇洗脱液中主要含有知母皂苷A3。将70%乙醇洗脱液回收乙醇，并浓缩至适当体积，即有知母皂苷A3析出，离心分离出沉淀，以低浓度乙醇 (20%)溶解，再上已处理好的AB-8大孔吸附树脂柱，吸附，以适量40%乙醇洗脱，再以70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，回收乙醇，并浓缩至适当体积，即有知母皂苷A3析出，离心分离，质量分数可达到90%以上，见图 2、图 3。3批质量分数结果分别为 95.36%、94.23%、93.28%。

图3 第1批知母皂苷A3色谱图

3 讨论

3.1 大孔吸附树脂分离技术在中药的提取分离中已经被广泛应用，是一种成熟的技术，多用于分离有效部位如总黄酮、总皂苷、总生物碱等，其吸附分离效果好，易于实现大生产。但大孔吸附树脂用于提取分离单一有效成分的应用报道尚不多见。本实验筛选出AB-8型大孔吸附树脂，采用较简单的分离纯化步骤结合知母皂苷A3在水中溶解度不大容易析出的特点，即可使知母皂苷A3的质量分数达到90%以上，具有制备周期短、适于大生产的优点，避免了用硅胶柱层析等方法使用大量混合有机溶剂、步骤多、产量小、不易实现批量生产的缺点。

3.2 上柱前药液采用水沉、萃取的工艺，可除去大部分杂质，使知母皂苷A3得到富集，除去黄酮类等成分的干扰，减轻杂质对树脂的污染，增强树脂对知母皂苷A3吸附的选择性，延长树脂的使用寿命。

3.3 应用大孔树脂来分离纯化知母皂苷A3，平均得率为0.11%，知母皂苷A3转移率为70.1%。

3.4 成品中知母皂苷A3的质量分数达到了90%以上，可研究开发成有效成分明确、剂量小、起效快、易于质量控制的现代中药制剂。

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