粪肠球菌的二氧化氯消毒试验

李荣光，何文杰，黄廷林，韩宏大，张甜甜，孟宪献

肠球菌是存在于人类或动物胃肠道的正常菌群[1,2]。为革兰氏阳性球菌，需氧或兼性厌氧，无鞭毛，无芽孢，少数菌株有荚膜，触酶试验阴性。自1984年以来，本菌属已分离出至少19种基因型[3,4]，粪肠球菌（Enterococcus Faecalis）是其中的一种。肠道菌能通过饮用水传播疾病，有效的消毒是保障饮用水安全的重要手段，通常以大肠杆菌为指示菌来评价消毒效果，但是只以一种细菌作为指示菌有很大的弊端，而目前肠球菌已被列入生活饮用水卫生标准附录[5]，因此对肠球菌消毒效果的研究就显得尤为重要。

通过实验室配制的磷酸盐缓冲液代替天然水进行试验有利于避免混淆各水质因素对消毒效果的影响，可以非常方便地调整各水质因素（如pH、温度）来研究它们对消毒效果的影响。大量的研究认为反应温度和pH值对氯的消毒效果有重要影响[6-12]。pH值的变化会影响消毒剂水解的化学平衡，从而提高或降低消毒剂的活性；温度的升高会增大消毒剂化学反应的速率；有机物的加入不但会消耗消毒剂，而且会起到稳定细菌的作用。

二氧化氯具有消毒能力强，持续时间长，消毒副产物少的优点也使其成为国际社会公认的氯系列消毒剂最理想的换代产品[13-15]。在美国有400多家水厂、欧洲有数千家水厂应用二氧化氯消毒[16]。在我国小规模的给水厂中亦有应用[17]，并且在农村也有应用[18]。

1 试验材料和方法

1.1 消毒剂

二氧化氯试剂通过稀释2%的稳定性二氧化氯获得。消毒剂在每次使用前标定浓度。使用N－二乙基对苯二胺（DPD）法对消毒剂进行检测，所用仪器为Pocket ColorimeterTMⅡ 二氧化氯检测仪（美国HACH公司）。

1.2 磷酸盐缓冲液（PBS）和菌悬液

磷酸盐缓冲液用0.1 mol/L的磷酸氢二钠和0.1 mol/L的无水磷酸二氢钠制备，调节pH为6、7.5和9（除pH影响消毒效果的研究外，其余试验均在pH=7.6±0.1的条件下进行）。

试验所用菌种为美国典型菌种保藏中心提供的粪肠球菌（ATCC19433）。菌悬液的制取：用5 mL的生理盐水将斜面上的细菌洗脱下来，加到营养肉汤中于37℃培养24 h到稳定期，再注入经121℃灭菌的离心管中于4 000 r/min下离心10 min，弃掉上清液并用相同体积的PBS清洗离心管底部的沉淀物，再次放入离心机在相同条件下离心，后用10 mL的PBS对细菌进行重悬，试验时将其稀释到所需浓度。

1.3 试验方法

取上述菌悬液1 mL加到盛有100 mL PBS的三角瓶中，加入消毒剂并用磁力搅拌器在400 r/min下进行缓慢搅拌。在预先设定的反应时间分别取出1 mL的水样加入到9 mL带有硫代硫酸钠中和剂的生理盐水中，稀释后用平板法进行计数[19]。

在进行温度影响的试验时，将盛有试验溶液的三角瓶放置在恒温水浴锅中，调节到试验所需温度，待温度恒定后，再加入消毒剂进行灭菌试验。

采用甘氨酸和腐植酸分别代表低分子量和高分子量有机物进行试验。取1 g甘氨酸加入到1 L经灭菌的去离子水中，配制成浓度为1 g/L的储备液。取1g腐植酸加到1 L经灭菌的去离子水中，使用0.1 mol/L的NaOH调节溶液的pH到12，待腐植酸溶解后，再用0.1 mol/L的HCl调节溶液pH到7.6左右，配制成浓度为1 g/L的储备液，并测定上述两种溶液的TOC值。使用时将溶液稀释到所需浓度。

1.4 数据拟合

数据拟合用Chick－Watson模型：

式中N——反应时间t时的存活细菌数，cfu/mL；

N0——反应时间0时的存活细菌数，cfu/mL；

k——反应速率常数，L/mg·min；

C——反应时间t时的消毒剂浓度，mg/L；

t——反应时间，min。

2 试验结果与讨论

2.1 pH值的影响

pH值对二氧化氯灭活粪肠球菌的影响如图1所示。

图1 pH值对二氧化氯灭活粪肠球菌的影响Fig.1 Effect of pH on Inactivation of Enterococcus Faecalis with Chlorine Dioxide

由1图可知在pH为6～9的范围内，随着pH值的增加，灭活速率逐渐变大，达到3log所需的Ct值在pH=9时比pH=6时的少48%。这与pH值对自由氯灭活细菌病毒的情况恰好相反。出现这种情况的原因可能是由于二氧化氯对细菌灭活的机理不同于自由氯，自由氯是溶于水后产生的次氯酸起作用，次氯酸呈酸性，所以低pH条件有利于自由氯灭活，而二氧化氯是通过单质分子的作用对细菌起到灭活效果，高pH值条件下产生的氢氧根离子可能对整个灭活过程起到了催化作用[20]。此外在pH值为7.5～9之间，灭活分为两个阶段：开始快速的灭活期和后期速率较慢的拖尾期。这与先前的研究者们经常观察到的生存曲线首先是一个指数的动力学接着是存活菌数量恒定或缓慢减少的拖尾现象的情况一致[21]。

2.2 温度的影响

温度对二氧化氯灭活粪肠球菌的影响如图2所示。

图2 温度对二氧化氯灭活粪肠球菌的影响Fig.2 Effect of Temperatrue on Inactivation of Enterococcus Faecalis with Chlorine dioxide

由2图可知随着温度的升高，二氧化氯的灭活速率逐渐变大。温度在由8℃提高到35℃时，达到3log所需的Ct值由 1.8 降低到 0.59 mg·min/L，减少了大约1/3倍。

温度对灭活速率常数的影响如图3所示。

图3 温度对二氧化氯灭活粪肠球菌反应速率常数的影响Fig.3 Effect of Temperatrue on Rate Constants for Inactivation ofEnterococcus Faecalis with Chlorine Dioxide

根据阿伦尼乌斯公式：

式中：k——反应速率常数，L/mg·min；

A——频率因子；L/mg·min；

Ea——活化能，J/mol；

R——气体常数，8.314 J/mol·K；

T——绝对温度，K。

将灭活速率常数k的自然对数（lnk）与温度的倒数（1/T）作图，由最小二乘法得出参数A=1.8×106 L/mg·min，二氧化氯灭活粪肠球菌的活化能Ea=30 396 J/mol，此结果小于臭氧灭活枯草杆菌的Ea=46 820 J/mol值[22]。

2.3 有机物的影响

有机物对二氧化氯灭活粪肠球菌的影响如图4所示。

图4 有机物对二氧化氯灭活粪肠球菌的影响Fig.4 Effect of Organic Matters on Inactivation of Enterococcus Faecalis with Chlorine Dioxide

试验时所投加的甘氨酸和腐植酸的TOC浓度均为0.4 mg/L。由图4可知当不存在有机物时，二氧化氯对粪肠球菌的灭活规律按照Chick-Watson定律进行。而当存在有机物时，灭活规律表现为一个快速的假一级动力学灭活，达到一定的灭活率时，出现了拖尾现象。投加甘氨酸和腐植酸后，二氧化氯对粪肠球菌的灭活效果明显下降，达到3log去除率所需的Ct值由1.22分别提高到1.84和3.58 mg·min/L，提高了 51%和近 2 倍。

此外在相同的TOC浓度下，代表大分子量的腐植酸对二氧化氯灭活粪肠球菌的影响大于同浓度下的甘氨酸，分析可能是因为二氧化氯在与大分子量的腐植酸反应时，将其氧化分解为小分子量的中间产物，而二氧化氯还可继续与这些中间产物反应，直到二氧化氯的剩余浓度为0或者是生成了最终产物为止，从而造成了腐植酸对灭活效果的反作用大于小分子量的甘氨酸。

3 结论

（1）与pH值对自由氯灭活细菌的影响情况恰好相反，随着pH值的增加，二氧化氯的灭活速率逐渐变大，pH=9时达到3log所需的Ct值比pH=6时的少48%。

（2）在8～35℃范围内，随着温度的升高，二氧化氯的灭活速率逐渐变大。且温度对灭活速率常数的影响符合阿伦尼乌斯定律。

（3）有机物的加入降低了二氧化氯对粪肠球菌的灭活速率，并且大分子量的腐植酸的的影响要大于小分子量的甘氨酸。

［1］ Shepard BD,Gilmore MS.Antibiotic－resistant enterococci:the mechanisms and dynamics of drug introduction and resistance[J].Microbes Infect,2002,4(2):215－224.

［2］Creti R,Imperi M,Bertuccini L,et al.Survey for virulence determinants among Enterococcus faecalis isolated from different sources[J].Journal of Medical Microbiology,2004,53:13－20.

［3］Murray PR.Manual of Clinical Microbiology[M].6th.Washingtong DC:American Society Microbiology,1995.

［4］ Mandell GL,Bennet t J E,Dolin R.Principles and practice of infectious disease[M].5th.New York:Churchill Livingstone,2000.

［5］GB 5749－2006,生活饮用水卫生标准[S].

［6］Benoit Barbeau,Lina Boulos.Examining the use of aerobic spore－forming bacteria to assess the efficiency of chlorination[J].Water Research,1999,13:2941－2948.

［7］ Corinne Le Dantec,Jean－Pierre Duguet.Chlorine Disinfection of Atypical Mycobacteria Isolated from a Water Distribution System[J].Applied And Environmental Microbiology,2002,3:1025－1032.

［8］David E.Johna,Charles N.Haas.Chlorine and ozone disinfection of Encephalitozoon intestinalis spores[J].Water Research,2005,39:2369－2375.

［9］钱振宇,崔玉杰,等.两种不同剂型二氧化氯消毒剂饮水消毒效果试验观察[J].中国卫生检验杂志,2009,19(7):1678－1679.

［10］韩艳淑,陈素良,等.二氧化氯发生器对饮用水消毒效果观察[J].中国消毒学杂志,2005,22(1):43－45.

［11］代园园,员建,苑宏英,等.二氧化氯作为消毒剂在饮用水处理中的应用[J].净水技术,2011,30(1):4－7.

［12］邹启光,关小红.二氧化氯取代液氯消毒剂的可行性研究[J].净水技术,2002,21(3):13－16.

［13］黄君礼.新型水处理剂——二氧化氯技术及其应用[M].北京:化学工业出版社,2002.

［14］黄君礼,吴明松.饮用水二氧化氯消毒技术的现状[J].净水技术,2010,29(4):16－18,31.

［15］陈济民.二氧化氯在消毒领域中的应用前景[J].净水技术,2003,22(1):15－16.

［16］邓玉良.二氧化氯的生产和应用评述[J].化学世界,2002,(1):46－49.

［17］王占生,刘文君.我国给水深度处理应用状况与发展趋势[J].中国给水排水,2005,21(9):29－33.

［18］姚新梅.二氧化氯消毒技术在贵州农村水厂中的应用[J].贵州大学学报 (自然科学版 ),2009,26(1):134－136.

［19］鲁巍,王云,张晓健.饮用水中几种细菌计数方法的比较[J].环境科学,2004,25(4):167－169.

［20］Kristen M.Ruffell,Jason L.Renneckerm.Inactivation of cryptosporidium oocysts with chlorine dioxide[J].Water Research,2000,3:868－876.

［21］R.Virto,D.Sanz,I.Modeling the effect of initial concentration of Escherichia coli suspensions on their inactivation by chlorine[J].Journal of Food Safety,2005,25:120－129.

［22］Min Cho,Hyenmi Chung,Jeyong Yoon.Quantitative Evaluation of the Synergistic Sequential Inactivation of Bacillus subtilis Spores with Ozone Followed by Chlorine[J].Environ.Sci.Technol.,2003,37:2134－2138.