普伐他汀减轻大鼠急性心肌梗死后瞬时外向钾电流的表达

杨海燕，佘 强，张玉方

(1.重庆市第三人民医院老年心血管科，重庆400014;2.重庆医科大学附属第二医院心血管内科，重庆400016;3.重庆市江北区第一人民医院药剂科，重庆400020)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后心肌细胞膜离子通道的异常活动，形成电重构，可能是导致AMI后出现心律失常的原因。抗心律失常药物的应用减少了心律失常的发生，但同时又有致心律失常的潜在风险，这就需要新的更安全的抗心律失常药物。他汀类药物目前研究较多，它具有抗心律失常作用［1］，尚未见报道其有致心律失常的作用，但其抗心律失常的机制尚不明确。瞬时外向钾电流(transient outward potassium current，Ito)在心肌动作电位的快速复极I期中起重要作用，目前认为大鼠Ito主要由Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3编码;研究发现，在大鼠AMI后，心室肌细胞Ito电流密度下降［2］，但尚无各时间点对比的报道。本研究观察大鼠AMI模型不同时间点Ito各基因表达的变化，及普伐他汀对AMI后Ito表达的影响，为AMI后心律失常的药物治疗提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立及分组

1.1.1 大鼠AMI模型的建立:SPF级雄性SD大鼠，体质量200～250 g，由重庆医科大学动物实验中心［SCXK(渝)2007-0001］提供，采用常规方法建立大鼠AMI模型［3］，假手术大鼠为前降支只穿线不打结。取成功手术大鼠20只，随机分为4组，每组5只。其中4组分别为手术后24 h组、手术后1周组、手术后4周组、手术后4周加普伐他汀治疗组(20 mg/kg每天灌胃1次，药物购自上海三共制药有限公司)及假手术组。后者15只，在前述3个时间点取心脏标本，每组5只。除普伐他汀组外其余各组均以等量0.9%氯化钠注射液灌胃。

1.1.2 采集心脏标本:在10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉下迅速处死大鼠，取右室游离壁，在0.9%氯化钠及0.1%DEPC水中清洗，置于液氮中保存。

1.2 Real-time PCR法检测Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3 mRNA

1.2.1 引物设计:使用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物。kv1.4上游引物5'-GAATGACACCT CGGCACCC-3'，下游引物 5'-AAACTCAAAGGAAAA CCACACG-3'，长度106 bp;kv4.2上游引物5'-CTT CTGCTTGGATACCGCC-3'，下游引物5'-AGCCCAAT GTAATAGGGTAGGAT-3'，长度144 bp;Kv4.3 上游引物 5'-TGCCTGGGAGCAAGGAACT-3'，下游引物5'-CACTGCGGATGAAGCGGTA-3'， 长 度 144 bp。β-actin上游引物 5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，下游引物 5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，长度150 bp。

1.2.2 Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3 mRNA相对表达量的检测:取右室心肌组织50～100 mg，采用Trizol试剂提取总RNA，取5 μL RNA模板行反转录成cDNA(反应条件:25℃ 10 min，40℃ 60 min，70℃ 10 min)。扩增目的基因和管家基因(反应参数:93℃ 2 min，93 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40 cycles)，其产物进行梯度稀释用于标准曲线绘制，按照ShineSYBR Real time qPCR Mastermix试剂盒(上海闪晶生物公司)说明书进行荧光定量扩增目的基因和管家基因，扩增条件为94 ℃ 4 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，40个循环。根据Ct值读出起始模板量后计算出目的基因的相对拷贝数。

1.3 Westernblot法检测 Kv1.4、Kv4.2及 Kv4.3蛋白

取右室心肌组织约100 mg，按100 mg/mL加入RIPA全蛋白提取液(上海申能博彩公司)，加入10 μL PMSF，冰上匀浆30 min，4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，取上清液20 μL BCA测定蛋白浓度。其余上清液加入等量2×上样缓冲液，于70℃加热10 min，以10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电转移蛋白至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，室温孵育2 h，加入一抗(兔抗大鼠 Kv1.4、Kv4.3和 Kv4.2，0.8 mg/mL)，37℃、60 r/min摇动90 min，弃去一抗，用Tris-HCl缓冲盐溶液洗涤3次，加入二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，1∶1 000)37℃孵育1 h，弃去二抗，再用Tris-HCl缓冲盐溶液洗涤3次。增强化学发光(ECL)显影，置于凝胶图像分析系统分析条带吸光度值。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3 mRNA的表达

假手术组各时间点右室心肌Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3 mRNA及蛋白质表达无明显差异。AMI后24 h，Kv1.4 mRNA表达开始增高，1周组、4周组与24 h组比较无明显差异;Kv4.2 mRNA表达在AMI后24 h开始降低，4周组更低，1周组较24 h组比较无明显差异;Kv4.3 mRNA表达在AMI后各时间点均降低，24 h组最低，1周组与4周组比较无明显差异，具体数据见表1。

表1 各组mRNA表达水平Table 1 mRNA expression of each group(n=5)

2.2 Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3蛋白质的表达

Kv1.4蛋白质表达在AMI后24 h开始增高，1周组、4周组与24 h组比较无明显差异，普伐他汀组与4周组比较表达降低;而Kv4.2及Kv4.3蛋白质在AMI后24 h开始降低，具体数据见表2，图1。

表2 各组蛋白质表达水平Table 2 Protein expression of each group(n=5)

2.3 普伐他汀组与 4周组 Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3 mRNA及蛋白质表达水平的比较

普伐他汀组Kv1.4 mRNA及蛋白质表达水平较4周组降低，而Kv4.2、Kv4.3 mRNA及蛋白质表达水平较4周组增高，具体数据见表1，表2及图1。

图1 各组Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3蛋白质表达Fig 1 Protein expression changes of Kv1.4，Kv4.2，Kv4.3

3 讨论

Ito是控制心室肌细胞动作电位时程的主要电流［4］。Ito有两种成分:慢成分(Kv1.4基因编码)及快成分(Kv4.2、Kv4.3基因编码)两种。Ito在心脏中的分布具有明显的组织特异性，心尖部大于基底部，心外膜大于心内膜，研究发现药物对Ito影响程度也和组织分布有关［5－6］。本研究选用大鼠右室心肌，其原因是在左室AMI后，右室代偿功能起着重要作用，也同样存在基因表达的变化，右室相对远离梗死区域，可以避免取材时组织缺血本身对Ito表达的影响，而且右室游离壁壁薄，量相对较少，检测时使用了全部右室标本，避免了Ito组织特异性分布对结果的影响。

AMI后心肌细胞的丢失引起心室重构，Ito电流下降，心肌细胞复极不均一，导致心律失常的发生［7］。研究发现犬及大鼠 AMI后 Ito电流密度下降，Kv1.4表达增高，而 Kv4.2及 Kv4.3表达降低［8－9］，但未见 AMI后各时间点变化趋势的报道。本文报道了大鼠AMI后 Kv1.4、Kv4.2及Kv4.3表达的变化趋势，为AMI后Ito研究的时间点选取提供依据。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)水平及AngⅡ1型受体、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、血浆游离脂肪酸的变化可以影响Ito的表达［10－11］，目前认为 AMI后 Ito表达变化的机制可能与AMI后循环及心肌局部AngⅡ增高及TNF表达增加所致。

他汀类药物能抑制心肌梗死后心肌局部AngⅡ产生，使AngⅡ1型受体活性下调，抑制TNF的表达及抗心律失常等作用，抗心律失常的机制尚不明确。有报道阿托伐他汀可阻止Ito在单纯缺血时持续减小的趋势［12］。本研究发现，普伐他汀能抑制 AMI后Kv1.4表达增高及Kv4.2、Kv4.3表达降低，其机制可能是他汀类药物抑制心肌局部AngⅡ产生、下调AngⅡ1型受体活性、抑制TNF的表达使Kv4.3及Kv4.2 mRNA表达增加，从而反转AMI后心肌细胞Ito的减少，减少AMI后复极不均一性，发挥AMI后抗心律失常的作用，但本实验未同时进行心肌局部AngⅡ、AngⅡ1型受体活性及TNF的表达的检测，其机制尚需进一步证实。

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