人全血培养方法筛选抗类风湿性关节炎青藤碱衍生物

王悦

人全血培养方法筛选抗类风湿性关节炎青藤碱衍生物

王悦

目的 通过人全血培养方法筛选有潜在抗类风湿性关节炎作用的青藤碱衍生物。方法 细菌酯多糖(LPS)刺激人全血诱导TNF-α产生, 加入青藤碱衍生物, ELISA法检测其对TNF-α生成的抑制作用。结果 浓度为10～4 mol/L 时, 青藤碱衍生物SIN-3、SIN-33对TNF-α的抑制率分别为22.9%和31.1%, 其中SIN-33的抑制作用明显比强于青藤碱(24.2%)， P＜0.05。结论 青藤碱衍生物SIN-33可明显抑制人全血中LPS诱导的TNF-α的生成, 可作为抗类风湿性关节炎候选药物进一步研究。

类风湿性关节炎；青藤碱；人全血培养；TNF-α

类风湿性关节炎是一种慢性自身免疫性疾病, 目前通常采用非甾体类抗炎药对症治疗以及各种抗风湿药物对疾病进行调节。因此, 临床上急需可同时调节类风湿性关节炎症状和进程的小分子药物。

青藤碱(sinomenine, SIN)是从中药青藤中提取的, 可抑制或治疗炎症、免疫反应和类风湿性关节炎。研究显示青藤碱可降低体内炎症细胞因子的mRNA表达［1］。本研究中根据文献对青藤碱C环和D环进行了修饰得到两个化合物(图1), 然后通过人全血方法检测对LPS刺激人全血后产生肿瘤坏死因子(TNF-α)的抑制作用, 并与青藤碱进行比较。

图1 青藤碱衍生物的化学结构

① 实验材料

青藤碱衍生物SIN-3和SIN-33(上海睿智化学研究有限公司合成)；青藤碱(＞99%, 陕西华昌生物工程公司)；LPS (Sigma公司)；人肿瘤坏死因子(TNF-α)酶联免疫检测试剂盒(R&D 公司)。

② 实验方法

从7名健康志愿者末梢静脉抽取100 μl外周血注入含EDTA无内毒素的采血管中, 放置1 h, 用 900 μl 的 RPMI 1640 (含10% 胎牛血清)对其进行稀释。把1μl SIN-3、SIN-33和SIN(10～4 mol/l)的二甲基亚砜溶液放入二十四孔板中, 每个样品重复双孔, 于37 ℃、5% CO2下培养15 min。然后除对照组外, 采用10 μl LPS(1 μg/ml)同样在37 ℃, 5% CO2下孵育6 h, 最后把培养板在冰浴上以终止反应。培养板在4℃以1500 rpm离心10 min, 吸取上清液, 采用人酶联免疫检测(ELISA)试剂盒来检测其中TNF-α含量, 计算各孔TNF-α含量变化的百分数。数据用(±s)E表示, 采用SPSS16.0软件单因素方差分析进行组间比较, P＜0.05时具有显著性差异。

3 结果

LPS刺激后, 人全血释放TNF-α的浓度为1868 pg/ml,而对照孔中TNF-α含量接近于零。如图2显示, 当浓度为10～4mol/L 时, SIN-3和SIN-33均可抑制TNF-α产生, 抑制率分别为22.9%和31.1%, 其中SIN-33明显比SIN 24.2%高(P＜0.05)。

图2 青藤碱衍生物在人全血中对TNF-α的抑制率(n=7)与SIN组比较,aP＜0.05

4 讨论

本研究中我们通过人全血方法比较青藤碱衍生物和青藤碱对LPS刺激产生TNF-α的抑制作用。LPS 是革兰氏阴性菌的主要成分, 常用于单核细胞等细胞分泌细胞因子的强力刺激物质［1］, 此方法目前为世界上公认的评价抗类风湿性关节炎新药的金标准。

TNF-α 是LPS刺激后产生最多的介导因子, 是抗关节炎病理过程的重要因子。有研究显示青藤碱减少TNF-α可能是其产生抗炎症作用的主要机制［2］。

本研究数据显示SIN-33在人全血中可诱导TNF-α的分泌, 说明它可成为新的抗类风湿性关节炎新药的候选药物,其抗关节炎作用可能也是由于抑制炎症因子如TNF-α的表达所引起。

［1］ Franchimont D, Louis E, Dewe W, et al. Effects of dexamethasone on the profile of cytokine secretion in human whole blood cell cultures. Regulatory Peptides. 1998(73): 59-65.

［2］ Zhou H, Wong YF, Wang J, et al. Sinomenine ameliorates arthritis via MMPs, TIMPs and cytokines in rats. Biochemical and Biophysical research communications, 2008(376): 352-357.

210029 南京医科大学第一附属医院临床医学研究院