川芎嗪长循环脂质体包封率的测定

2013-09-14陈道阳陈晓丹王利胜

中国医药导报 2013年14期

陈道阳陈晓丹王利胜

1.广东省人民政府机关门诊部，广东广州 510030；2.广州中医药大学中药学院，广东广州 510006

川芎嗪是从中药川芎中提取的一种主要有效成分，具有扩张血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、改善微循环等多种药理活性[1]，临床主要用于治疗动脉粥样硬化、冠心病、脑血管病、肺动脉高压等疾病[2]。长循环脂质体是一种具有多功能的靶向药物载体，其在体内可阻止巨噬细胞对脂质体的识别和摄取，而极大延长脂质体在血液中的循环时间[3]。把川芎嗪制成长循环脂质体制剂，可显著改善川芎嗪口服吸收差、生物利用度低、半衰期短、代谢快等问题，有效提高了川芎嗪的疗效。本实验旨在建立简单可行、稳定可靠的分析方法，以准确测定川芎嗪在制剂中的含量和包封率，为评价和控制川芎嗪长循环脂质体的质量提供依据。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪：Waters515泵、2487紫外检测器（美国Waters公司）；N3000色谱工作站（浙江大学）；精密分析天平AUW120D（日本岛津公司）；JB-3型定时恒温磁力搅拌器（上海雷磁新泾仪器有限公司）；微孔滤膜（德国ME MBRANA公司）。

TMP（含量>98.5%，江苏南京泽朗医药科技有限公司）；大豆卵磷脂（上海泰伟药业）；胆固醇（上海伯奥生物科技有限公司）；PEG3000-DSPE（德国lipoid公司）；葡聚糖凝胶-G50（上海蓝季科技发展有限公司）；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（天津市福晨化学试剂厂）；甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品的制备

2.1.1 川芎嗪长循环脂质体[4]采用乙醇注入法制备，精密称取处方量的川芎嗪、卵磷脂、胆固醇和PEG3000-DSPE，加入适量的无水乙醇使之溶解。将上述乙醇溶液匀速注入到水浴60℃的PBS 6.5溶液中，恒温快速搅拌至无醇味，静置，过0.45 μm的微孔滤膜，即得。

2.1.2 空白脂质体按处方精密称取卵磷脂、胆固醇、PEG 3000-DSPE等辅料，同法制备不含药物的空白脂质体，备用。

2.2 分析方法的建立[5]

2.2.1 色谱条件色谱柱：迪马platisil ODS柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），Phenomenex保护柱；流动相：甲醇-0.5%冰乙酸（40∶60）；流速：1 mL/min；柱温：室温；检测波长：298 nm；进样量：10 μL。

2.2.2 专属性试验取空白脂质体和川芎嗪长循环脂质体各0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇破乳并定容至刻度，摇匀，分别作为阴性溶液和样品溶液。将阴性溶液、样品溶液和43.60 μg/mL的川芎嗪对照品溶液分别进行HPLC分析。色谱图见图1，川芎嗪的保留时间约为13.2 min，峰形良好，空白辅料对川芎嗪的测定无干扰。

2.2.3 标准曲线的绘制精密称取川芎嗪对照品8.72 mg，用甲醇配制成浓度为 1.09、2.18、5.45、10.90、21.80、43.60 μg/mL的对照品溶液，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积A为纵坐标，对照品溶液浓度C（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。得到线性回归方程：A=24 178.21C-101.40（r=0.9995），表明川芎嗪在 1.09～43.60 μg/mL 浓度范围内线性关系良好。

2.2.4 精密度试验取10.90 μg/mL川芎嗪对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积，计算得到RSD为1.41%，说明该法精密度良好。

2.2.5 稳定性试验取川芎嗪长循环脂质体适量，用甲醇破乳并稀释，摇匀，于室温放置 24 h，分别于 0、2、4、6、8、10、12、24 h进样分析，记录峰面积，计算得到RSD为1.79%，说明样品溶液在24 h内基本上稳定。

2.2.6 重复性试验取同一批号的川芎嗪长循环脂质体5份，按“2.2.2”项下配制样品溶液，进行分析，结果川芎嗪质量浓度稳定，RSD为1.26%，符合要求。

2.2.7 回收率试验精密量取 2.18、10.90、43.60 μg/mL的川芎嗪对照品溶液1 mL，分别加入空白脂质体1 mL，加甲醇破乳并定容至10 mL，配制成低、中、高3个浓度的混合溶液各5份，进行液相色谱分析，计算回收率，分别为98.55%（RSD=1.59% ），97.64% （RSD=1.37% ），99.14% （RSD=1.78%），结果表明该分析方法的回收率符合要求。

2.3 分离方法的建立[6]

2.3.1 洗脱曲线的绘制精密量取川芎嗪长循环脂质体0.25 mL，上葡聚糖凝胶-G50微型柱（15 cm×0.8 cm），以PBS 6.8为洗脱液，流速为0.5 mL/min，每毫升为1管收集洗脱液，共收集25管。可见，乳白色的脂质体富集于3～10管洗脱液中。将每管洗脱液用甲醇定容至2 mL，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，测定川芎嗪的含量。以药物质量浓度为纵坐标，收集份数为横坐标，绘制洗脱曲线。图2结果表明川芎嗪长循环脂质体于3～12 mL被洗脱出，而末包封的游离药物于15～23 mL被全部洗脱出来，中间有3 mL间隔，确保了脂质体与游离药物能够完全分离。

2.3.2 柱回收率测定精密量取2.18、10.90、43.60 μg/mL的川芎嗪对照品溶液0.25 mL上柱，按上述条件进行洗脱，收集15～23 mL的洗脱液，稀释，定容，过0.22 μm微孔滤膜，HPLC法分别测定药物浓度，计算川芎嗪游离药物的上柱洗脱回收率。结果低、中、高浓度的川芎嗪柱回收率分别为97.41% （RSD=1.24% ），99.01% （RSD=1.51% ），96.80%（RSD=1.39%），表明葡聚糖凝胶-G50对川芎嗪没有吸附作用，在以上条件下药物可被完全洗脱。

2.3.3 川芎嗪长循环脂质体包封率的测定[7]精密量取川芎嗪长循环脂质体混悬液0.25 mL，缓缓加于葡聚糖凝胶-G50微型柱（15 cm×0.8 cm）顶部，用 PBS 6.8以 0.5 mL/min的流速进行洗脱，以1 mL/管为单位收集3～12管的洗脱液，合并，加甲醇破乳并定容至18 mL，混合均匀，过0.22 μm微孔滤膜，HPLC测定脂质体中包封的药量。另取川芎嗪长循环脂质体混悬液0.25 mL，用甲醇破乳并稀释定容至5 mL，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，进样分析，测定的川芎嗪的含量为包封和未包封的药物总量。按以下公式计算包封率：包封率=脂质体中包封的药物／药物总量×100%。三批川芎嗪长循环脂质体样品的包封率测定结果见表1。

表1 川芎嗪长循环脂质体的包封情况（%）

3 讨论

3.1 测定方法的选择

脂质体包封率的测定方法有很多，在前期试验中曾采用超速离心法，在转速20 000 r/min以上长时间离心，但脂质体仍难以完全沉淀分离，而且在高转速条件下部分脂质体可能被破坏而导致药物渗漏；透析法虽能有效分离，但操作耗时过长[8]。相比之下，凝胶柱色谱法简单可靠，能使包封药物和游离药物得到较好的分离。

3.2 葡聚糖凝胶柱分离条件

本研究选用葡聚糖凝胶G-50能达到较好的分离效果。在分离过程中，色谱柱的径高比、洗脱液的流速及上样量均会影响脂质体与游离药物的分离效果[9]。宜选择能达到最大分离程度的洗脱条件，才能保证包封率测定的准确性。通过前期筛选试验，选择径高比为15 cm×0.8 cm，上样量为0.25 mL，洗脱液为PBS 6.8，流速为0.5 mL/min的洗脱条件，能使川芎嗪长循环脂质体可与游离药物达到最大程度分离。