硫化氢抑制前列腺癌骨转移P C-3细胞增殖和侵袭的体外研究

黄新宇 杨远良 许国华 容锡沧 冯瑞强

1.广东省江门市人民医院骨科，广东江门 529000；2.广州市番禺区中心医院骨一科，广东广州 511400

前列腺癌发病率居美国男性恶性肿瘤中第一位[1]，每年因前列腺癌死亡的患者数仅次于肺癌居第二位，其发病率在我国也呈逐年升高趋势。前列腺癌最易发生骨转移，85%～100%死于前列腺癌的患者中合并骨转移[2]。发生骨转移后临床上缺乏有效的治疗手段，其确切转移机制目前也不十分清楚[3-4]。因此，探寻新的治疗前列腺癌骨转移的方式及药物很有必要。硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）是一种能溶于水有臭鸡蛋气味的气体，作为一种气体信号分子受到越来越广泛的研究[5]。在哺乳动物、鱼类乃至无脊椎动物体内，都可以生成内源性H2S气体，发挥类似神经递质的中枢调节作用。H2S发挥生物学效应的重要机制是调节细胞的增殖和凋亡[6-7]，Li等[8]报道硫化氢促进恶性胶质瘤的生长，Cao等[9]报道硫化氢导致胰腺腺癌细胞凋亡。目前的研究发现，释放硫化氢的非甾体抗炎药提高其对前列腺癌细胞的抗癌作用[10]，但机制还不太明确。本试验以硫氢化钠（sodium hydrosulfide，NaHS）作为硫化氢的供体，探讨硫化氢对前列腺癌骨转移PC-3细胞生长、侵袭的影响，并初步探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

NaHS购自Sigma公司；cck-8购自同仁公司；胎牛血清购自Gibco公司；抗 Bcl-2、抗 Bax和 Western-Blot检测试剂盒购自Cell Signaling Technology Inc。细胞蛋白提取试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 细胞培养

前列腺癌细胞系PC-3购自ATCC，细胞置于含10%胎牛血清F-12培养基中，于37℃、5%CO2条件培养，取对数生长期细胞进行试验。

1.3 细胞存活率的检测

根据 NaHS浓度将实验分为 0、1、2、4 mmol/L四组，每组均作用PC-3细胞36 h，检测不同浓度下细胞存活率。取对数生长期细胞，以10 000个/孔接种于96孔板，37℃、5%CO2条件下培养过夜待细胞贴壁，用含有不同处理因素的培养基培养细胞，每组设5个复孔。处理结束后加入CCK-8（每孔 100 μL 加 10 μL CCK-8），轻摇，37℃孵育 4 h，然后用酶联免疫检测仪测定每孔在450 nm波长处的吸光度（OD）。取5孔OD值的平均值，按公式计算各组细胞存活率，存活率（%）=（实验组 OD-空白对照组 OD）/（正常对照组OD-空白对照组OD）×100%，实验重复3次，以0 mmol/L NaHS组为对照组，存活率为100%。

1.4 Transwell侵袭实验

用0、1、2、4mmol/L NaHS分别作用PC-3细胞36h后，在具有8 μm小孔聚碳酸酯滤膜的培养小室上铺用预冷无血清F-12培养基稀释的Matrigel基质胶，接种100 μL无血清培养基稀释的 PC-3细胞（5×105个/mL），下室加入600 μL含10%血清的F-12培养液，每组设6个复孔。37℃、5%CO2条件下培养24 h后，取出培养小室，用棉签轻轻拭去未穿过滤膜的细胞，用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色30 min。倒置荧光显微镜下观察、照相，并每组随机选取5个视野计数每高倍视野滤膜底面的平均细胞数。

1.5 ELISA检测PC-3上清液MMP-2、MMP-3分泌

用0、1、2、4mmol/LNaHS分别作用PC-3细胞36 h后，胰酶消化细胞，以1×104个/孔接种于96孔板，1%血清的F-12培养液培养48 h后，收集上清液，4℃离心，ELISA检测PC-3上清液MMP-2、MMP-9分泌情况，以0 mmol/L NaHS组为对照组，分泌量为100%。

1.6 Western-Blot法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达

PC-3细胞接种于培养皿中，培养至80%满时按各试验组要求加入不同处理因素。按操作说明书提取细胞胞浆蛋白和核蛋白，BCA法进行蛋白定量。总蛋白经SDSPAGE分离后，转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭1.5 h。随后加入抗 Bcl-2（1∶1000）或抗 Bax（1∶1000）或抗GAPDH（1∶3000）4℃孵育过夜，TBST 漂洗 7 min×3 次，加入相应的二抗（羊抗兔 IgG 1∶3000），常温孵育 1 h，TBST 漂洗10 min×3次。将PVDF膜用发光剂显色后曝光到X光片上。

1.7 统计学方法

用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析或t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NaHS对前列腺癌骨转移PC-3细胞存活率的影响

用 0、1、2、4 mmol/L NaHS 分别作用 PC-3 细胞 36 h，与对照组（0 mmol/L NaHS）相比，各组细胞存活率降低。1 mmol/L NaHS组细胞存活率与对照组比较，差异无统计学意义 （P＞0.05）；2、4 mmol/L组与对照组比细胞存活率下降NaHS作用PC-3细胞36 h，细胞存活率降低，与对照组比较，能不同程度抑制PC-3细胞的生长，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见图1。

图1 NaHS降低前列腺癌骨转移PC-3细胞存活率

2.2 NaHS对前列腺癌骨转移PC-3细胞侵袭的影响

用 0、1、2、4 mmol/L NaHS 分别作用 PC-3 细胞 24、36 h后，Transwell侵袭实验观察NaHS对前列腺癌骨转移PC-3细胞侵袭的影响。与对照组（0 mmol/L NaHS）相比，各组穿膜细胞数降低。1 mmol/L组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），2、4 mmol/L组与对照组比较细胞存活率下降（P＜0.05或P＜0.01）。见图2。1 mmol/L NaHS组细胞侵袭数与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；2、4 mmol/L NaHS作用PC-3细胞36 h，细胞侵袭数减少，与对照组比较，能不同程度抑制PC-3细胞的侵袭，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见图2。

图2 NaHS降低前列腺癌骨转移PC-3细胞侵袭

2.3 NaHS降低前列腺癌骨转移PC-3细胞分泌MMP-2、MMP-9

用0、1、2、4 mmol/L NaHS分别作用PC-3细胞36 h后，ELISA检测 PC-3细胞 48 h后上清液中MMP-2、MMP-9表达变化。与对照组（0 mmol/L NaHS）相比，各组MMP-2、MMP-9分泌量降低。1 mmol/L组差异无统计学意义 （P＞0.05），2、4 mmol/L组与对照组比细胞存活率下降（P＜0.05或P＜0.01）。见图3。1 mmol/L NaHS组细胞MMP-2和MMP-9分泌量与对照组比较，差异无统计学意义 （P＞0.05）；2、4 mmol/L NaHS作用PC-3细胞36 h，MMP-2和MMP-9分泌量减少，与对照组比较，能不同程度抑制PC-3细胞MMP-2和MMP-9的分泌，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见图3。

2.4 NaHS对前列腺癌骨转移PC-3细胞Bcl-2/Bax蛋白表达的影响

用0、1、2、4 mmol/L NaHS分别作用PC-3细胞24 h后，Western blot检测Bcl-2/Bax蛋白表达变化。与对照组（0 mmol/L NaHS）比较，各组Bcl-2 表达逐渐降低，Bax蛋白表达逐渐升高（图4）。与对照组（0 mmol/L NaHS）比较，1、2、4 mmol/L NaHS组Bcl-2表达逐渐降低，Bax蛋白表达逐渐升高，呈浓度依赖性（图4）。

3 讨论

硫化氢作为继一氧化氮、一氧化碳后被发现的第3种气体信号分子，在不需要载体蛋白的情况下，可直接透过细胞膜，在不同的组织细胞间有不同的生理浓度，对细胞的生长和凋亡起着不同的作用[11]。对肿瘤细胞而言，即使是对同一种肿瘤不同细胞系，硫化氢的所起的作用亦会有所用不同：Cao等[12]报道内源性和外源性硫化氢均抑制结肠癌细胞增殖，而Rose等[13]报道硫化氢抑制HCT116结肠癌细胞凋亡。

本试验中，2、4 mmol/L NaHS对前列腺癌骨转移PC-3细胞的存活率有影响（P＜0.05或P＜0.01），而1 mmol/L NaHS差异无统计学意义。提示：较低浓度（1 mol/L）硫化氢对前列腺癌骨转移PC-3细胞的生长没有较大影响。较高浓度（2、4 mol/L）硫化氢能抑制前列腺癌骨转移PC-3细胞的生长。

图3 NaHS降低前列腺癌骨转移PC-3细胞分泌MMP-2、MMP-9

图4 Western blot检测Bcl-2/Bax蛋白表达变化

通过对胞浆Bcl-2、Bax蛋白蛋白表达的检测，本文观察到NaHS能够降低Bcl-2表达和促进Bax表达。Bcl-2、Bax基因均属于Bcl-2家族，分别是Bcl-2家族中最具有代表性的抗凋亡和促凋亡的基因。Bax蛋白主要位于胞浆，当凋亡发生时，它从胞浆转移到线粒体外膜上，调控凋亡诱导蛋白细胞色素C的释放，导致细胞凋亡[14]。Bcl-2蛋白位于线粒体膜上，能与Bax蛋白结合成二聚体，阻止Bax蛋白的释放，从而抑制细胞的凋亡[15]。因此，硫化氢可能是通过抑制Bcl-2表达和促进Bax表达来抑制前列腺癌骨转移PC-3细胞的活性。

肿瘤侵袭和转移是一个多步骤的、肿瘤细胞与宿主细胞相互作用的生物学过程。其中，细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）和血管基膜（basement membrane，BM）的降解是转移多阶段过程中的重要步骤。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在该过程中起重要作用，是降解ECM和BM的主要酶类。Brehmer等[16]对40例PCa切除术后的标本以免疫组化方法检测MMP2和MMP-9，结果表明，与正常前列腺组织相比，MMP-9在肿瘤细胞和肿瘤内及周边的基质细胞中高表达，MMP-2、MMP-9的表达随格里森积分增加有1个增加的趋势。Dong等[17]的实验研究表明，在前列腺癌细胞PC-3骨转移组织中，PC-3诱导破骨细胞活性增加以及破骨细胞募集到骨重塑处，都依赖于MMP-9的表达。Sauer等[18]对97例PCa患者血清、活检组织及前列腺切除术后的肿瘤组织进行MMP-2、MMP-9检测。结果表明，血清中MMP-9表达显著增加，且与肿瘤分级有关，而MMP-2在前列腺切除术后的肿瘤组织中，与肿瘤分级呈正相关。

本文研究发现，较低浓度（1 mol/L）硫化氢对前列腺癌骨转移PC-3细胞的侵袭没有较大影响。较高浓度（2、4mol/L）硫化氢作用前列腺癌骨转移PC-3细胞24 h，能使细胞的侵袭数下降，提示较高浓度硫化氢（2、4 mmol/L）能抑制前列腺癌骨转移PC-3细胞的侵袭，同时较高浓度硫化氢（2、4 mmol/L）能抑制前列腺癌骨转移PC-3细胞MMP-2、MMP-9分泌，而较低浓度（1 mol/L）硫化氢对前列腺癌骨转移PC-3细胞MMP-2、MMP-9分泌无明显影响。因此，硫化氢可能抑制了前列腺癌骨转移PC-3细胞MMP-2、MMP-9分泌来降低侵袭。

目前的研究发现，以非甾体抗炎药（NSAID）双氯芬酸和美沙拉秦为母体合成可释放H2S的衍生物ATB-337和ATB-429[19-20]，释放硫化氢的非甾体抗炎药提高其对前列腺癌细胞的抗癌作用[10]。本研究发现硫化氢可能是通过上述机制来增强非甾体抗炎药对前列腺癌细胞的抗癌作用。因此，随着对硫化氢进一步研究，从抑制凋亡和侵袭入手，可能为前列腺癌骨转移治疗提供了一条新的途径。

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