褪黑素对急性脊髓损伤大鼠血清及脊髓内神经生长因子表达的影响

亓英国

山东省莱芜市人民医院市中分院骨三科，山东莱芜 271100

褪黑素（melatonin，MT）是一种由松果体分泌的具有多种生物效应的神经内分泌激素，以往多种研究表明其对脊髓损伤具有清除氧自由基、抗炎、减少神经细胞凋亡等脊神经保护作用[1-3]，而对其促进神经系统修复及对神经生长因子（nerve growth factor，NGF）水平影响的相关研究较少。NGF是首个被发现的内源性神经营养因子，由神经细胞和神经胶质细胞分泌，对神经细胞具有强大的修复、保护作用[4]。本研究通过观察MT对脊髓损伤大鼠血清及脊髓内NGF表达水平的影响，探讨MT对损伤脊髓保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

84只 8～10 周健康成年雄性 SD 大鼠，体重（250±30）g，购自广东省医学实验动物中心[许可证号：SCXK（粤）2011-0004]。

1.2 试剂与仪器

MT、苏木精、伊红均购自美国Sigma公司，无水乙醇、10%水合氯醛、大鼠NGF检测酶联免疫吸附法试剂盒、兔抗鼠NGF多克隆抗体、Trizol试剂、DAB试剂均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，PCR试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。美国ABI PCR 9700型PCR扩增仪，美国STAT FAX2100全自动酶标仪，北京君意JY025型凝胶紫外分析仪，HPIAS-1000彩色病理图像报告分析系统。

1.3 脊髓损伤动物模型建立

依据改良Allen法制作脊髓损伤大鼠模型[5]。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，T11～13为术区，备皮消毒后做正中纵向切口暴露目标棘突和椎板，咬除椎板暴露脊髓硬膜，范围约0.6 cm×0.3 cm。采用质量为10 g的条形金属重锤于距硬膜2.5 cm处做自由落体运动打击暴露处脊髓形成脊髓急性损伤。以大鼠尾部及下肢出现抽搐、硬膜充血水肿为模型建立成功标准。清洗、消毒后缝合术口。

1.4 分组及实验方法

采用随机数字表法将大鼠分为模型对照组（36只）、模型MT组（36只）及假手术组（12只），模型对照组和模型MT组随机分为A、B、C亚组，各12只。模型对照组和模型MT组依“1.3”法制作模型，判断模型成功后，模型对照组各亚组给予100 mg/kg无水乙醇1次，腹腔内注射；模型MT组各亚组给予100 mg/kg MT注射液腹腔内注射1次。假手术组则仅依“1.3”法暴露硬膜，并不损伤脊髓。三组术后进行神经功能评价，继续人工饲养，均给予抗感染（青霉素20万U/d肌注）治疗，生存期＞3 d则给药3 d，人工辅助排尿排便（4次/d）。术后12 h模型对照组及模型MT组的A组再次进行神经功能评价后断头处死取材，模型对照组及模型MT组的B、C组分别于术后3、5 d进行神经功能评价后断头处死取材。

1.5 观察指标检测

1.5.1 血清NGF检测 大鼠断头取血2 mL室温静置30 min，3000 r/min离心15 min取血清储存于-20℃冰箱备用。采用大鼠NGF检测酶联免疫吸附法试剂盒检测血清NGF水平，操作方法按试剂盒说明进行。

1.5.2 脊髓组织NGF免疫组化检测 解剖患处，取以T12为中心的约1 cm脊髓生理盐水冲洗，均分为2段。上段进行常规制片苏木精-伊红染色，厚度5 μm，各组按1∶5比例取5张切片，采用兔抗鼠NGF多克隆抗体按试剂盒说明进行染色标记，DAB显色，于显微镜下观察。HPIAS-1000彩色病理图像报告分析系统对每张片随机5个400倍视野阳性神经细胞进行计数，取平均值。神经细胞细胞质、细胞核均呈棕色或棕褐色为阳性。

1.5.3 脊髓组织NGF mRNA检测 采用PCR扩增法。脊髓标本下段于-80℃冻存，取冻存样品研碎后采用Trizol法提取总RNA并逆转录为cDNA，以GAPDH为内参进行PCR扩增，引物序列见表1。取5 μL产物进行凝胶电泳，分析图像对比NGF与GAPDH灰度值，以其比值作为NGF mRNA相对表达量。

1.5.4 神经功能评价 采用Tarlov评分法对大鼠进行神经功能评价，0～5分为完全瘫痪至正常。脊髓损伤模型完成后Tarlov评分为1～4分方能继续进行实验。

表1 脊髓组织NGF mRNA PCR扩增引物序列

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，多组数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脊髓损伤大鼠模型及神经功能情况

模型对照组和模型MT组72只大鼠脊髓损伤模型均建立成功，术后12 h两组Tarlov评分显著低于假手术组（P＜0.05），模型MT组Tarlov评分稍高于模型对照组，但无统计学意义（P＞0.05）；术后 3、5 d模型MT组Tarlov评分均显著高于模型对照组（P＜0.05或P＜0.01）。见表2。

2.2 脊髓损伤大鼠血清NGF水平

术后12 h、3、5 d模型对照组和模型MT组血清NGF水平均显著上升，模型MT组NGF水平高于模型对照组（P＜0.05或 P＜0.01），见表 2。

2.3 脊髓损伤大鼠脊髓组织NGF蛋白表达情况

脊髓切片中NGF阳性神经细胞染色呈棕褐色，集中于脊髓前角及周围灰质。术后12 h模型对照组和模型MT组NGF蛋白在脊髓组织中的表达均显著高于假手术组。见图1。模型对照组、模型MT组术后12 h、3、5 d NGF蛋白在脊髓组织中的表达呈上升趋势，而模型MT组上升更为显著且高于模型对照组（P＜0.05）。见表2。

2.4 脊髓损伤大鼠脊髓组织NGF mRNA表达情况

术后模型对照组和模型MT组脊髓组织NGF mRNA表达升高，显著高于假手术组（P＜0.05）；模型MT组脊髓组织NGF mRNA表达均显著高于模型对照组（P＜0.05或P ＜ 0.01）。 见表 2、图 2。

表2 三组各时间点Tarlov评分、血清NGF水平、脊髓组织NGF阳性细胞计数及 mRNA表达情况比较（±s）

表2 三组各时间点Tarlov评分、血清NGF水平、脊髓组织NGF阳性细胞计数及 mRNA表达情况比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，#P＜0.05，△P＜0.01，“-”代表无数据；NGF：神经生长因子

假手术组Tarlov评分（分）血清 NGF（ng/L）NGF阳性细胞计数（个/HP）NGF mRNA模型对照组Tarlov评分（分）血清 NGF（ng/L）NGF阳性细胞计数（个/HP）NGF mRNA模型MT组Tarlov评分（分）血清 NGF（ng/L）NGF阳性细胞计数（个/HP）NGF mRNA 5.00±0.00 31.63±2.18 4.29±0.48 0.097±0.012 2.48±0.27*37.82±3.49*7.34±0.56*0.374±0.05*2.61±0.32*48.35±4.13*#9.28±0.67*#0.431±0.095*#----2.53±0.23 39.24±4.21 8.28±0.63 0.439±0.073 2.95±0.42#56.32±5.32#13.26±0.89#0.763±0.102#----2.52±0.32 42.85±3.82 8.35±0.87 0.462±0.071 3.11±0.45△61.85±6.83△14.93±0.95△0.893±0.121△组别 术后12 h 术后3 d 术后5 d

3 讨论

MT在神经系统中分布广泛且具有多种生物效应，已经被证实在减轻对脊髓神经细胞的破坏、减少凋亡等方面对脊髓损伤患者神经系统具有保护作用，作为一种功能复杂的内源性激素，MT对神经细胞的增殖、分化同样具有调控作用[6]。NGF通过刺激凋亡抑制因子bal-2表达升高，抑制凋亡促进因子bax蛋白表达，促使bal-2与bax比值偏移，从而减少神经细胞的凋亡。高表达的NGF对损伤轴突有促进生长和加速再生的作用，并且在中枢及周围神经系统中对神经细胞的发育、分化、生长、再生和功能恢复均有重要调控作用[7-8]。内源性NGF在脊髓损伤后表达会保护性升高，但由于无法维持有效浓度从而达不到促进神经系统修复的作用。

本研究采用大鼠建立脊髓损伤模型，由于NGF基因属即早基因，因而在术后立即给药，术后12 h NGF早期表达并开始对神经细胞转归产生影响，术后内源性NGF呈现上升趋势，到第5天达到峰值，因此，本研究选择了术后12 h、3及5 d作为观察时点。研究发现，MT有促脊髓损伤大鼠体内血清及脊髓组织中NGF水平升高作用。通过对三组大鼠术后12 h神经系统功能评价发现，两个模型组大鼠Tarlov评分均显著低于假手术组，而模型MT组评分稍高于模型对照组，但差异不显著。可能由于脊髓仍处于休克状态，症状缓解表现尚不明显。而此时两模型组血清NGF水平、脊髓组织切片NGF蛋白及NGF mRNA表达水平已较假手术组显著上升，模型MT组上升幅度明显高于模型对照组，此后两模型组大鼠体内NGF表达均有上升趋势，模型MT组血清和脊髓中NGF表达出现大幅度升高，而模型对照组上升趋势则较为平缓。不仅如此，两组神经功能恢复状态也呈现显著差异，术后3、5 d模型MT组Tarlov评分有显著回升，下肢运动功能逐渐恢复，且据观察发现大鼠精神状态较好，饮食恢复较快，而模型对照组则进展不明显。表明脊髓损伤大鼠神经功能严重受损，而内源性NGF生理性出现升高，起到保护神经系统的作用，但效果并不佳，而通过给予MT促进内源性NGF的表达，大鼠体内NGF水平明显升高，并可到达有效浓度，对神经系统再生和功能修复产生作用。NGF直接给药会受到利用率低、半衰期短等限制[9]，而MT具有高度脂溶性和水溶性，可轻易透过血脑屏障和细胞膜进入核内发挥作用[10]，促进内源性NGF表达，自身也具有较强的神经保护作用，治疗脊髓损伤具有明显优势。

综上所述，MT对脊髓损伤后神经系统不仅具有减少损伤的保护作用，还通过促进体内NGF的表达促使神经细胞及轴突的再生，调节神经细胞增殖、分化，改善神经功能，增强对神经系统的保护。

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