MicroRNA-29b在动脉粥样硬化血管中的表达

伍韵贤 曾昭华 苏子焯 刘宝骅 杜一鹏 梁丽英

1.广州医学院第一附属医院心血管内科，广东广州 510375；2.广东省广州市海珠区石溪中医医院内科，广东广州 510375

MicroRNA-29（miR-29）是新近发现的一类小分子RNA家族，能识别特定的mRNA，并在转录后水平负性调控靶基因的表达[1]。MiR-29可通过直接抑制多种细胞外基质蛋白表达和调控多种与纤维化相关的信号通路参与纤维化的过程[2]。miR-29 包括 miR-29a，miR-29b 和 miR-29c，本实验通过观察Apo-E（-/-）小鼠主动脉根部血管miR-29b表达情况，了解miR-29b与动脉粥样硬化斑块形成过程的相关性。

1 材料与方法

1.1 动脉粥样硬化动物模型建立

实验组（FS 组）：8 只，雄性，体重在 18～22 g，5 周龄，SPF级载脂蛋白E基因敲除（C57BL/6J-ApoE）小鼠。对照组（NS组）：8只，雄性，相同体重范围及相同周龄的SPF级C57BL/6J小鼠。实验用小鼠均购自北京大学动物中心，在广州呼吸疾病研究所国家重点实验室的SPF级动物房饲养。高脂喂食15周（1%胆固醇+15%猪油），饮用水为蒸馏水，饮水及饲料不限。饲养室温保持在18～20℃，环境相对湿度40%～70%。小鼠20周龄取材。

测体重，取血测总胆固醇（total cholesterol，TC），预测模型组TC水平比正常对照组高6～10倍时，模型建立可能成功。遂取血管标本观察有无动脉粥样硬化斑块形成，以确定模型建立是否成功。如无明显动脉粥样硬化斑块形成，则继续高脂饲养周数，直到动脉粥样硬化模型预评达标。

1.2 血管标本及血清的取材

1.2.1 摘除眼球法取血 1%戊巴比妥钠0.1 mL/kg，腹腔注射麻醉。待小鼠翻身反应消失，摘除眼球，将血液滴入含10%EDTA及抑肽酶的抗凝管内。取血约1 mL。血液离心（3000 r/min，10 min）后，取血清至 Eppendorf管。

1.2.2 血管标本的提取 取血完成后，使用手术剪剪开小鼠胸腔及腹腔。暴露心脏，在右心房剪1小口，用注射器穿入左心室，给予冰冻生理盐水缓慢输注灌洗，至肝脏及心肌颜色变白，右心房流出的液体基本变清亮为止。打开胸、腹腔，去除肺脏及腹腔内器官。分离胸主动脉和腹主动脉血管全程，剪取主动脉并以冰冻生理盐水冲洗。每组小鼠取1根完整血管标本纵向剖开，并染色，以观察血管整体改变；其余全部血管置于-80℃冰箱中保存。

1.3 血脂水平的测定

将取材后血清送广州医学院第一附属医院检验科，用全自动生化分析仪检测TC含量。

1.4 主动脉血管壁MiR-29b的表达

取出-80℃保存的主动脉，应用荧光定量PCR技术，检测血管的miR-29b表达。

1.5 统计学方法

采用软件SPSS 17.0进行统计学分分析。计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型的评估

高脂饲养15周后，两组指标的比较如下：FS组和NS组体重[（29.10±2.53）g 和（33.20±5.18）g]无明显差异（P ＞0.05）；FS 组较 NS 组血清 TC[（13.52±1.58）mmol/L 和（2.12±0.35）mmol/L]显著增高（P ＜ 0.01）。 见表 1。

表1 动脉粥样硬化动物模型的一般指标比较（±s）

表1 动脉粥样硬化动物模型的一般指标比较（±s）

注：与NS组比较，*P<0.01

FS组（n=8）NS 组（n=8）29.10±2.53*13.52±1.58 33.20±5.18 2.12±0.35组别 体重（g） 总胆固醇（mmol/L）

2.2 血管内膜病理肉眼改变

剖开主动脉弓可见：FS组内膜面有淡黄色斑块状隆起，散在或融合成片，其长轴多与血管长轴平行，病变最明显在血管分叉处；NS组，血管内膜光滑、平整，无脂质沉积。

2.3 苏丹Ⅳ染色

FS组：主动脉内膜肉眼所见斑块状隆起处被染成猩红色，整个被苏丹Ⅳ染色部分呈片状分布，与内膜正常部分红白分明；NS组血管内膜光滑，几乎不存在任何红染，呈现内膜本色（白色）。见图1。

2.4 HE染色

图1 主动脉苏丹Ⅳ染色

FS组：主动脉血管内膜明显增厚，呈圆弧状或新月状凸起；可见大量胞浆内含有大量脂质空泡的泡沫细胞形成；内弹性膜被破坏；中膜平滑肌增生明显且不规则排列；NS组，主动脉血管壁分层清晰，血管内膜完整、光滑、无增厚；内皮下无脂质沉积；中膜平滑肌细胞规则整齐排列。见图2。

以上指标显示该Apo-E基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型构建成功。

2.5 主动脉血管壁miR-29b的表达

FS组主动脉弓miR-29b的表达较NS组明显降低[平均吸光度值：（2.10±0.27）和（17.56±1.07）]明显降低（P<0.01），提示在动脉粥样硬化模型主动脉中存在miR-29b的低表达。

3 讨论

可能与心血管事件发生有密切相关的miRNAs目前证 实 有 ：miR-1、miR-126、miR-199、miR-29b、miR-30、miR-133等。MiR-29是新近发现的一类与纤维化疾病密切相关的小分子RNA家族。人类的miR-29的家族拥有3个成熟成员，分别为miR-29a、miR-29b和 miR-29c。MiR-29b含两个基因编码簇，其直接目标至少有16个细胞外基质基因。miR-29b与促细胞分化和凋亡的调控[3-4]、心肌肥厚[5]的发生、发展密切相关。Van Rooij等[6]指出，miR-29家族对急性心肌梗死后心肌组织纤维化的mRNA编码，如：胶原蛋白、纤维蛋白等细胞外基质蛋白和弹性蛋白起抑制调控作用。Boon等[2]指出，miR-29可通过直接抑制多种细胞外基质蛋白表达和调控多种与纤维化相关的信号通路参与纤维化过程。在小鼠和人类动脉中，血管老化及年龄相关病变引起miR-29家族的显著上调。

本实验在Apo-E基因敲除小鼠主动脉中，采取逆转录酶聚合酶链技术对miR-29b的表达进行研究。结果显示，在高脂饲养的Apo-E基因敲除小鼠的主动脉中，形成典型的动脉粥样硬化斑块；动脉粥样硬化血管中miR-29b表达减少，与血管壁老化导致miR-29b表达上升[2]相反。提示可能miR-29b对血管壁局部负性调控减弱，有利于动脉粥样硬化的形成；或者是动脉粥样硬化形成后产生对miR-29b表达的抑制所导致。

笔者推测在高脂喂食的Apo-E基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型中，miR-29b低表达可能与动脉粥样硬化斑块的形成有关。

[1]Ambros V.MicroRNA pathways in flies and worms：growth，death，fat，stress，and timing[J].Cell，2003，113（6）：673-676.

[2]Boon RA，Seeger T，Hevdt S，et al.MicroRNA-29 in aortic dilation：implications for aneurysm formation[J].Circ Res，2011，109（10）：1115-1119.

[3]Kriegel AJ，Liu Y，Fang Y，et al.The miR-29 family：genomics，cell biology，and relevance to renal and cardiovascular injury [J].Physiol Genomics，2012，44（4）：237-244.

[4]Chen KC，Wang YS，Hu CY，et al.OxLDL up-regulates microRNA-29b，leading to epigenetic modifications of MMP-2/MMP-9 genes：a novel mechanism for cardiovascular diseases[J].Faseb J，2011，5（5）：1718-1728.

[5]Cheng Y，Ji R，Yue J，et al.MicroRNAs are aberrantly expressed in hypertrophic heart：do they play a role in cardiac hypertrophy[J].Am J Pathol，2007，170（6）：1831-1840.

[6]Van Rooij E，Sutherland LB，Thatcher JE，et al.Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（35）：13027-13032.