外周血miR-29a-3p、miR-365a-3p在活动性肺结核和结核潜伏感染者中的表达

刘守江 张 帆 魏 巍 覃林珍 闫 敬 王三清 王 健

广东省深圳市南山区慢性病防治中心结核病防治科，广东深圳 518054

微小 RNA（microRNA，miRNA）是一类广泛存在于真核细胞中，长度约20 nt的高度保守的非编码RNA调控因子，是由全长的mRNA样转录子加工而来，通过与对应的靶mRNA的3'非翻译区的非完全或完全配对结合，阻止其翻译或破坏其稳定性，实现对基因表达的调控，越来越多的研究表明，miRNA在肿瘤、糖尿病、心血管疾病、病毒感染等多种疾病中都起着重要作用，是正常和疾病状态下基因调节的一个新的机制[1-2]。近年miRNA在肺结核患者中表达也是研究热点之一。本研究主要探讨miR-29a-3p、miR-365a-3p分子在活动性肺结核（TB）和结核潜伏感染（LTBI）者外周血中的表达情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集深圳市南山区慢性病防治院（以下简称“我院”）结核病防治科门诊2012年1～10月诊治的TB患者30例，其中男 17例，女 13例，平均年龄（26.1±10.1）岁，诊断标准：经痰抗酸杆菌涂片阳性，临床症状结合X线表现、CT诊断以及病原学检查，符合全国结核病分类与诊断标准；LTBI者 30例，其中男 14例，女16例，平均年龄（28.9±9.5）岁，判定标准：采用结核菌特异性酶联免疫斑点试验阳性，而胸片未见异常[3]。两组研究对象之间的年龄、性别比较差异无统计学意义 （P＞0.05）。所有研究对象均排除HBV、HCV、HIV病毒感染及其他慢性疾病如高血压、糖尿病、肾炎、自身免疫性疾病等。所有研究对象均经我院伦理委员会批准通过，并签署知情同意书。

1.2 标本的收集和处理

抽取外周静脉血2 mL，30 min内分装200 μL全血于冻存管中（已预装有Trizol和研磨珠），振荡混匀后-80℃保存；根据Trizol Reagent试剂盒说明书（Invitrogen）抽提总RNA，核酸测定仪测定浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性；-80℃保存。

1.3 研究方法

1.3.1 全血RNA提取 加入1 mL Trizol，充分裂解细胞，加入 200 μL 氯仿，剧烈振荡 15 s，室温放置 3 min，12 000 r/min，4℃，离心15 min。吸取上层水相，至另一离心管中。加入1.5倍体积异丙醇充分混匀，室温放置10 min。12 000 r/min，4℃，离心10 min，RNA沉淀于管底，倾倒上清，沉淀物用75%乙醇洗涤2次，室温晾干10 min，加入适量无RNase水充分溶解，调整RNA浓度。

1.3.2 反转录-荧光定量PCR检测 miRNA反转录反应体系为 20 μL，0.5 g/L 总 RNA 1 μL，2×反转录缓冲混合物 10 μL，RNase Free 水 5 μL，反转录酶 2 μL，0.1%BSA 2 μL。反转录反应条件为 37℃ 60 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。荧光定量 PCR 反应体系为 25 μL，cDNA 模板 2 μL， 水 8.5 μL，SYBR Green 12.5 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL。荧光定量PCR反应条件为预变性95℃10 s；变性和延伸95℃5 s；60℃ 20 s，共40个循环。引物采用在线设计软件：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/；管家基因U6为内参照，测得的数据用平均相对含量表示。引物由invitrogen合成，引物序列见表1。

表1 反转录-荧光定量PCR引物序列（5'-3'）

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，比较两组间差异采用t检验，相关性分析采用Pearson检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血miR-29a-3p在活动性肺结核和结核潜伏感染者中的表达

对活动性肺结核患者和LTBI外周血miR-29a-3p数据进行分析，结果表明，外周血miR-29a-3p表达在LTBI（1.16±0.65）中明显高于活动性肺结核患者组（0.71±0.32）（P＜0.05）。见图1。

2.2 外周血miR-365a-3p在活动性肺结核和结核潜伏感染者中的表达

对活动性肺结核患者和LTBI外周血miR-365a-3p数据进行分析，结果表明，活动性肺结核组外周血miR-365a-3p 表达（0.32±0.71）与 LTBI（0.43±0.51）比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

2.3 结核潜伏感染者外周血miR-29a-3p表达与结核菌特异性酶联免疫斑点数相关性分析

相关性分析发现，LTBI外周血miR-29a-3p表达与结核菌特异性酶联免疫斑点数呈负相关 （r=-0.42，P=0.02）。见图3。

3 讨论

miRNA在细胞生长发育、分化、增殖、凋亡、肿瘤发生等发生发展中均起到重要作用。越来越多的研究发现miRNAs表达失调与多种疾病发生（如病毒感染、心血管疾病、肺部疾病、纤维化、肿瘤等）密切相关。近年来研究也发现miRNA可以参与调节免疫细胞的成熟、增殖、分化和活化，miRNA通过选择性表达，干扰、降解或抑制靶基因的mRNA，从而调控免疫反应，其在固有免疫应答和适应性免疫应答中均起到重要作用，如通过下调信号通路TCR中多种蛋白磷酸激酶活性，调节TCR信号通路强度[4]；通过下调促凋亡蛋白和肿瘤抑制因子，促进T细胞、B细胞增殖；通过下调SOCS1信号通路调节Treg细胞发育[5]、通过下调AID调节B细胞抗体类别转换[6-7]，以及通过下调多种转录因子调节髓样细胞的增殖和分化等多种形式。

microRNA-29a（miR-29a）是新近发现的一个与多种疾病发生紧密相关的小分子RNA家族，除3'端非编码区碱基区域（3'untranslated region，3'UTR）外，miR-29 也可与非3'UTR区内的miRNA调节元件（miRNA regulator elments，MRE）结合发挥作用。弹性蛋白3'UTR和编码区共有14个miR-29的结合位点，荧光素酶报告基因分析方法证实：miR-29可通过同时与编码区内和3'UTR的MRE结合来抑制弹性蛋白表达，编码区内的MRE在miR-29抑制弹性蛋白的表达中起到了协同作用。研究发现miR-29靶基因主要的是细胞外基质及迁移蛋白[8-9]，miR-29可直接抑制多种胶原蛋白表达。而胶原蛋白异常聚集可导致纤维化，因此miR-29在抗纤维化中起到重要作用。目前研究也发现miR-29a在机体免疫反应中也起到重要作用，miR-29a靶基因相关蛋白参与多个信号通路。miR-29a可通过抑制这些信号蛋白表达参与多条信号通路的调控。其中miR-29a是经典Wnt通路中信号分子——T细胞因子（T-cellfactor，TCF）或淋巴样增强因子（lymphoi denhancer factor，LEF）的负调控分子，miR-29a可通过靶向降解IFN-γ降低机体对胞内病原体的免疫应答[10-11]。本研究也发现LTBI外周血miR-29a-3p表达明显高于活动性肺结核患者组，LTBI外周血miR-29a-3p表达与结核菌特异性酶联免疫斑点数呈负相关，miR-29a-3p表达高的，结核菌特异性酶联免疫斑点数却较少，而结核菌特异性酶联免疫斑点数反应了T细胞分泌IFN-γ的能力，因此miR-29a-3p在肺结核感染、发病过程中可能起到重要作用。

IL-6是介导组织炎症的重要细胞因子，趋化、活化中性粒细胞和单核细胞，促进炎症递质释放，增强局部炎性反应。研究发现miR-365a可负性调节IL-6表达，抑制IL-6蛋白生成，miR-365通过与IL-6基因的3'UTR的MRE结合，直接抑制IL-6 mRNA表达，除此之外，miR-365也可能通过非直接途径抑制IL-6表达，体外实验发现miR-365调节IL-6的能力超过let-7a[12]，因此miR-365a在炎性反应中也起到重要作用，但本研究中并未发现结核潜伏感染者和活动性肺结核之间差异，miR-365a-3p在肺结核发病中的作用还需进一步研究。

综上所述，miRNA-29a表达在肺结核感染、发病过程中可能起到重要作用。随着研究的不断深入，miRNA-29a将在肺结核诊断及致病机制中作用更加清楚、明确，且有可能成为区别结核潜伏感染者的一个重要标志分子。

[1]Calin GA，Ferracin M，Cimmino A，et al.A MicroRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia[J].N Engl J Med，2005，353（17）：1793-1801.

[2]Lu J，Getz G，Miska EA，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers[J].Nature，2005，435（7043）：834-838.

[3]Chen X，Yang Q，Zhang M，et al.Diagnosis of active tuberculosis in China using an in-house gamma interferon enzyme-linked immunospot assay[J].Clin Vaccine Immunol，2009，16（6）：879-884.

[4]Li QJ，Chau J，Ebert PJ，et al.miR-181a is an intrinsic modulat or of T cell sensitivity and selection[J].Cell，2007，129：147-161.

[5]Lu LF，Boldin MP，Chaudry A，et al.Functi on of miR-146a in cont rol ling T regcell mediated regulation of Th1 responses [J].Cell，2010，142：914-929.

[6]Dorsett Y，McBride KM，Jankovic M，et al.MicroRNA-155 suppresses activation-induced cytidine deaminase mediated MycIgh trans location[J].Imunity，2008，28：630-638.

[7]Teng G，Hakimpour P，Landgraf P，et al.MicroRNA-155 is a negative regulator of activation-induced cytidine deaminase [J].Immunity，2008，28：621-629.

[8]Gebeshuber CA，Zatloukal K，Martinez J.miR-29a suppresses tristetraprolin，which is a regulator of epithelial polarity and metastasis[J].EMBO Rep，2009，10（4）：400-405.

[9]Fort A，Borel C，Migliavacca E，et al.Regulation of fibrinogen production by microRNAs[J].Blood，2010，116（14）：2608-2615.

[10]Kapinas K，Kessler C，Ricks T，et al.MiR-29 modulates Wnt signaling in human osteoblasts through a positive feedback loop[J].J Biol Chem，2010，285（33）：25221-25231.

[11]Sharbati J，Lewin A，Kutz-Lohroff B，et al.Integrated microRNA-mRNA-analysis of human monocyte derived macrophages upon mycobacterium avium subsp，homin issuis infection [J].PLoS One.2011，6（5）：20258.

[12]Xu Z，Xiao SB，Xu P，et al.miR-365，a novel negative regulator of interleukin-6 gene expression，is cooperatively regulated by Sp1 and NF-kappa B[J].J Biol Chem，2011，286（24）：21401-21412.