脂多糖诱导膀胱癌细胞释放HMGB1及其机制研究

陈 文 李 蕾 陈国千

南京医科大学附属无锡市人民医院检验科，江苏无锡 214023

膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其绝大多数为移行细胞癌。膀胱癌目前以手术治疗为主，但五年生存率低。慢性感染和炎症被认为是肿瘤发生、发展极为重要的原因之一。高迁移率族蛋白B1（HMGB1）作为一种核内DNA结合蛋白，可以分泌到胞外并介导炎性反应，是一种重要的晚期促炎症因子[1]。研究显示，HMGB1的高表达与肿瘤细胞增殖、浸润、转移以及患者预后等关系密切[2]。最近研究表明，HMGB1在膀胱癌组织中高表达，且与肿瘤的分级、分期及患者预后相关[3-4]。脂多糖（LPS）可以诱导单核细胞、巨噬细胞等主动释放HMGB1到胞外[5-6]。LPS对膀胱癌细胞诱导HMGB1释放作用尚未见研究报道，本研究旨在观察LPS对膀胱癌细胞释放HMGB1的影响，并探讨其相关信号通路机制，为阐明疾病治疗新途径提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人膀胱移行细胞癌细胞株T24购自中国科学院细胞库；RPMI-1640培养液、OPTI-MEM I培养液购自美国Gibco公司；LPS、LY294002 购自美国 Sigma公司，HMGB1 ELISA试剂盒购自日本Shino-Test公司；Trizol、 逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。HMGB1、GAPDH引物由日本TaKaRa公司合成。

1.2 细胞培养

使用含 10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培养液，将人膀胱癌细胞株T24置于5%CO2培养箱中培养，至细胞达到对数生长期时，换用无血清OPTI-MEM I培养液。首先经预实验筛选出LPS的合适浓度和LY294002的不同浓度及检测培养上清液中HMGB1含量的最佳时间。选择100 μg/L LPS为作用浓度。只加OPTI-MEM I培养液组为对照组，加含100 μg/L LPS培养液组为LPS诱导组，并于LPS诱导6、12、18、24 h检测培养上清液中HMGB1浓度和细胞HMGB1 mRNA表达水平。加100 μg/L LPS及不同浓度LY294002组为LY294002干预组，LY294002预处理时于100 μg/L LPS诱导前1 h加入培养细胞，干预24 h后，收集细胞培养液，然后离心取上清液检测HMGB1含量。每组实验均重复3次。

1.3 HMGB1浓度测定

采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清液中HMGB1浓度。按试剂盒说明书进行实验。

1.4 HMGB1 mRNA测定

根据Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测定其浓度和纯度。按照逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。HMGB1上游引物：TTGTCGGGAGGAGCATAA，下游引物：GGGCGATACTCAGAGCAGAA，扩增产物长度为267 bp。内参为3-磷酸甘油醛脱氢酶 （GAPDH），上游引物：AACGGATTTGGTCGTATTG，下游引物：GGAAGATGGTGATGGGATT，扩增产物长度为208 bp。PCR循环参数为95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火/延伸20 s，循环40次。以目的基因HMGB1和内参GAPDH的Ct值之差（△Ct）作为评价目的基因mRNA相对表达水平的指标。目的基因mRNA的相对量按公式：目的基因=2-△△Ct计算。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 18.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用双侧t检验分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS对膀胱癌细胞HMGB1释放的影响

膀胱癌细胞T24经100 μg/L LPS诱导12、18、24 h后，培养上清液中HMGB1含量均高于各自对照组（P＜0.05或 P＜0.01），分别为对照组的 1.9、3.5、4.2 倍，见表1。

表1 不同细胞培养时间下脂多糖对膀胱癌细胞培养上清液中HMGB1 含量的影响（μg/L，±s，n=3）

表1 不同细胞培养时间下脂多糖对膀胱癌细胞培养上清液中HMGB1 含量的影响（μg/L，±s，n=3）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

对照组LPS诱导组2.77±0.41 2.67±0.57 2.87±0.52 5.31±0.90*组别 6 h 12 h 3.07±0.57 10.79±1.19**4.22±0.46 17.56±2.47**18 h 24 h

2.2 LPS对膀胱癌细胞HMGB1 mRNA表达的影响

膀胱癌细胞 T24 经 100 μg/L LPS 诱导 12、18、24 h后，细胞HMGB1 mRNA表达水平均高于各自对照组（P＜0.05或 P＜0.01），分别为对照组的 2.2、2.3、3.2倍。见表2。

2.3 PI3K/AKT信号通路抑制剂对LPS诱导膀胱癌细胞HMGB1释放的抑制作用

PI3K/AKT信号通路抑制剂20、40μmol/L LY294002对LPS诱导24 h的膀胱癌细胞T24释放HMGB1均显示明显的抑制作用（P＜0.01）。40 μmol/L 的 LY294002抑制作用强于 20 μmol/L（P＜0.05）。10 μmol/L的LY294002对LPS诱导的膀胱癌细胞释放HMGB1未起抑制作用（P＞0.05）。见图1。

表2 不同细胞培养时间下脂多糖对膀胱癌细胞高迁移率族蛋白B1 mRNA 表达的影响（△Ct，±s，n=3）

表2 不同细胞培养时间下脂多糖对膀胱癌细胞高迁移率族蛋白B1 mRNA 表达的影响（△Ct，±s，n=3）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

对照组LPS诱导组4.29±0.56 3.97±0.49 4.56±0.57 3.41±0.37*组别 6 h 12 h 4.28±0.46 3.08±0.32*4.30±0.45 2.60±0.35**18 h 24 h

图1 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路抑制剂对脂多糖诱导膀胱癌细胞释放HMGB1的影响（n=3）

3 讨论

HMGB1是普遍存在于真核细胞核内重要的非组蛋白染色体结合蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移速度快而被命名。HMGB1过去被认为是染色质的结构成分，功能局限在核内，主要参与稳定核小体结构、促进基因转录、参与DNA复制及调节类固醇激素等活动。1999年，Wang等[1]首次发现HMGB1可以介导炎性反应，是一种重要的晚期炎症介质。

HMGB1可以在细胞因子如白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、LPS等因素刺激下，由单核细胞、巨噬细胞等主动分泌；也可由坏死细胞或受损细胞被动释放。HMGB1参与许多疾病的病理过程，如脓毒症、肿瘤等[2,7]。研究表明，HMGB1在肝癌、结肠癌、肺癌等人类恶性肿瘤中呈高表达，并与肿瘤的进展及患者预后等相关[2]。HMGB1在膀胱癌中的研究极少，最新研究发现，HMGB1在膀胱癌组织中高表达，且与肿瘤的分级、分期及患者预后有关[3]。但HMGB1在膀胱癌中的具体分子作用机制尚未见研究报道。

本研究以LPS作为刺激因素，探讨其对膀胱癌细胞T24 HMGB1释放的影响。应用台盼蓝染色法检测到100 μg/L LPS诱导24 h后，各组膀胱癌细胞存活率均在95%以上，因而排除了细胞通过坏死损伤发生的HMGBl被动释放。本研究显示，膀胱癌细胞经缺氧诱导12 h后，培养上清液中HMGB1蛋白含量较常氧对照组升高，并呈时间依赖性，24 h达到峰值。本研究亦测定了细胞HMGB1基因表达水平，实验结果显示，LPS诱导12 h时细胞HMGB1基因水平已显示增高，提示LPS诱导的HMGB1释放增加受转录水平调控。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路作为细胞内重要的信号转导通路之一，在细胞的生长、存活、增殖、凋亡、血管生成、自吞噬等过程中发挥着极其重要的生物学功能[8-11]。有研究显示，PI3K/AKT通路活性改变与肿瘤的发生和发展密切相关。本研究应用PI3K特异性抑制剂LY294002进行细胞实验，结果显示干预LY294002对LPS诱导24 h的膀胱癌细胞释放HMGB1具有抑制作用。40 μmol/L 的 LY294002抑制作用强于 20 μmol/L。10 μmol/L的LY294002对LPS诱导的膀胱癌细胞释放HMGB1没有影响。提示胞内PI3K/AKT信号通路参与LPS诱导膀胱癌细胞HMGB1的释放，可为膀胱癌的临床治疗提供新的靶点和策略，为抗肿瘤药物的开发提供新的研究方向。HMGB1介导炎性反应还可能涉及其他途径及细胞因子的作用，Chen等[5]研究表明，LPS诱导的巨噬细胞HMGB1释放与CD14、TNF依赖途径有关；杨岚等[12]报道LPS诱导肥大细胞HMGB1释放涉及MAPK通路。LPS诱导的膀胱癌细胞HMGB1释放是否还涉及其他信号通路有待深入研究。

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