高效液相色谱法测定不同厂家银翘解毒片中连翘酯苷A的含量

张宏伟 龚 韬 严文利 李 静

1.北京积水潭医院，北京 100035；2.北京市卫生局临床药学研究所，北京 100035

银翘解毒片收载于《中国药典》2010年版，为临床常用中成药，由金银花、连翘、薄荷、荆芥、淡豆豉、牛蒡子、桔梗、淡竹叶、甘草9 味药组成，具有疏风解表，清热解毒功效。用于风热感冒，症见发热头痛、咳嗽口干、咽喉疼痛[1]。连翘为银翘解毒片的主要药味，实验证明，连翘酯苷是连翘的主要成分之一，具有一定的活性，对革兰解毒片的主要药味。实验证明，连翘酯苷是连翘的主要成分之一，具有一定的活性，对革兰氏阴性菌所致的感染有很好的对抗作用[2]，对呼吸道常见病毒有一定的抑制作用[3]。随着近年来对连翘有效成分的深入研究，发现其发挥抗菌作用的主要成分连翘酯苷，包括连翘酯苷A、B、C、D、E等，尤以连翘酯苷A 含量最高[4]。现代研究表明，连翘酯苷A 具有极强的抗菌及抗病毒活性，为连翘主要有效成分之一[5]。因此对连翘及含有连翘的制剂进行质量评价时，以连翘酯苷A 作为评价指标更客观、合适[6]。《中国药典》2010年版连翘中增加了连翘酯苷A 含量测定的方法[7]，而银翘解毒片项下并无连翘酯苷A的含量测定方法及其含量标准。本实验采用高效液相色谱法对银翘解毒片中连翘酯苷A 进行了含量测定，方法简单，易于操作，并且准确度、精密度、灵敏度、稳定性等指标均符合要求，因此可作为检测和控制该制剂质量的含量指标。同时又对来自全国不同厂家的银翘解毒片中连翘酯苷A的含量进行测定，结果显示在0.038%～0.286%之间，差距很大。因此应当完善银翘解毒片的质量控制标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器

日本岛津2010 高效液相色谱仪；Kromasil100AC18（5μm，150 mm ×4.6 mm） 色谱柱；METTLER TOLEDO XP105型分析天平；KQ-500DB型超声波清洗仪；

1.2 试药

连翘酯苷A对照品（天津马克生物技术有限公司，纯度>98%）；银翘解毒片（A 厂家：北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号：1121179；B 厂家：陕西利君现代中药有限公司，批号：100706；C 厂家：广西禅方药业有限公司，批号：110401；D 厂家：佛山德众药业有限公司，批号：11006；E 厂家：贵州百花医药股份有限公司，批号：110801；F 厂家：新疆库尔勒龙之源药业有限公司，批号：20100803；G 厂家：江西心诚药业有限公司，批号：20110501；H 厂家：云南省腾冲制药厂，批号：110613；I 厂家：桂林中族中药股份有限公司，批号：110801）乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适应性试验

色谱柱：Kromasil 100A C18（5 μm，150 mm×4.6 mm）；流动相：乙腈-0.4%冰醋酸（13∶87）；流速 1.0 mL/min；检测波长330 nm；柱温30℃；进样量10 μL；理论塔板数按连翘酯苷A 计算应不低于5 000。依上述色谱条件，精密吸取连翘酯苷A对照品溶液及供试品溶液各10 μL，分别进样，记录色谱图，见图1、2。本实验条件下，连翘酯苷A 与其他化学成分能达到基线分离。

图2 银翘解毒片样品高效液相色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取连翘酯苷A对照品适量，加甲醇制成每1 毫升含68.4 μg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取本品10 片，研细，混匀，取1 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定重量，超声处理（功率 500 W，频率 40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取浓度为0.228 mg/mL的连翘酯苷A对照品溶液 1、2、3、4、5、6、7、8 μL 注入液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标进行线性回归，计算回归方程为：Y=9281.393+1 434 119.256X，r=0.999 99，结果表明连翘酯苷A 进样量在0.228～1.824 μg范围内与峰面积具有良好的线性关系。

2.4 空白考察

按处方工艺制备不含连翘的样品，按供试品溶液的制备方法制备成空白溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，得空白图谱，见图3。结果表明空白无干扰。

2.5 中间精密度试验

分别用不同的仪器（岛津LC-2010 高效液相色谱仪、岛津LC-10A 高效液相色谱仪）及不同的色谱柱（Kromasil 100A C18，5 μm，150 mm×4.6 mm，Agilent ZORBAX C18，5 μm，250 mm ×4.6 mm）对同一批样品（A 厂家，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂：批号1121179）进行测定，计算，连翘酯苷A 含量的RSD 为0.84%。

2.6 重复性试验

取同一批样品（A 厂家，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂：批号1121179）的银翘解毒片粉末6份，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，进样分析，结果制剂中连翘酯苷A的平均含量为0.151%，RSD 为0.62%，表明该法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一份供试品溶液，分别于 0、2、4、6、8、10 h 进行测定，根据测定的连翘酯苷A 峰面积的结果计算RSD 为0.44%，表明供试品溶液在10 h 内稳定。

2.8 准确度（回收率）试验

取同一批样品（A 厂家，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂：1121179）的银翘解毒片粉末6份，每份0.5 g，精密称定，各精密加入浓度为0.037 2 mg/mL的连翘酯苷A对照品溶液20 mL，按供试品溶液制备方法制备，按“2.1”项下的色谱条件进样10 μL 测定，计算回收率。结果测得回收率在98.18%～100.22%之间，平均回收率为99.16%，RSD 为0.76%。见表1。

图1 连翘酯苷A对照品高效液相色谱图

表1 连翘酯苷A准确度（回收率）试验结果

2.9 样品测定

取9 批不同厂家的银翘解毒片，按供试品溶液制备方法制备，按“2.1”项下的色谱条件进样10 μL 测定，计算含量，结果见表2。

表2 不同厂家银翘解毒片中连翘酯苷A的含量（n=2）

3 讨论

3.1 提取溶媒及溶剂量的选择

本实验分别考察了用甲醇及70%甲醇溶液作为提取溶媒，对样品中连翘酯苷A 提出率的影响。结果表明，两种溶媒无明显差异，故选择甲醇作为提取溶媒。同时又对提取溶剂量进行了考察，分别用甲醇15、20、25 mL 提取，考察对样品中连翘酯苷A 提出率的影响。结果表明提取溶剂量对样品提取无显著影响，在保证样品提取完全的基础上，同时减少溶剂的使用，故采用20 mL 甲醇提取。

3.2 提取时间的选择

分别对样品超声处理20、30、40 min，样品中连翘酯苷A的含量基本一致，故选择超声处理30 min。

3.3 含量测定

连翘是银翘解毒片的主要成分，其有效成分的含量直接影响着药品的质量，临床用药的疗效，夏伯侯等[8]为《中国药典》2010年版建立了连翘药材中连翘酯苷A的含量测定方法，也充分证明了连翘酯苷A 作为连翘的有效成分之一，其含量标准测定的意义。因此此项研究参考《中国药典》2010年版对连翘酯苷A 含量测定的方法，对银翘解毒片中连翘酯苷A的含量进行了测定，操作方法简便，灵敏，具有良好的重复性和稳定性，所以可用于银翘解毒片中连翘酯苷A的质量控制。同时运用HPLC 法测定不同厂家银翘解毒片中连翘酯苷A的含量，测定结果显示九个不同厂家的数值均不相同，其含量在0.038%～0.286%，相差甚远，这势必会对临床疗效产生一定的影响。由此可见虽然《中国药典》2010年版比起以往版本已经提高了质量控制标准，但是因为只对此制剂中极少的药效成分规定了含量标准，作为有效成分之一的连翘脂苷A 没有含量标准，所以无法更全面地控制市场流通渠道中银翘解毒片的质量。因此呼吁相关部门完善银翘解毒片的质量控制标准，更好地保证药品的质量及其临床的疗效。

[1]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：1088-1089.

[2]冯淑怡，李先荣，孙建宁.连翘酯苷抗感染、解热作用研究[J].现代生物医学进展，2006，6（10）：73-75.

[3]胡克杰，徐凯建，王跃红，等.连翘酯苷体外抗病毒作用的实验研究[J].中国中医药科技，2001，8（2）：89.

[4]王曙宾，郑亚杰.连翘提取物和连翘酯苷A 原料中连翘酯苷A的稳定性研究[J].中草药，2010，41（6）：909-911.

[5]靖会，李教社，杨银京.不同部位、不同产地及不同采集时间连翘中连翘酯苷 A 的含量测定[J].陕西中医，2010，31（10）：1406-1407.

[6]姜艳艳，石任兵，刘斌，等.RP-HPLC 法测定连翘中连翘脂苷A的含量[J].北京中医药大学学报，2009，32（8）：565-570.

[7]赵昱玮，于淼，南敏伦，等.高效液相色谱法测定银翘解毒片中连翘酯苷 A 的含量[J].中国医药科学，2011，11（22）：114-115.

[8]夏伯侯，朱晶晶，王智民，等.连翘药材新增定量标准研究[J].中国中药杂志，2010，35（16）：2110-2112.