荷叶不同炮制品提取物对正常大鼠凝血功能影响的比较研究

2013-09-14张学兰李慧芬

中成药 2013年1期

彭凯，张学兰，王莉，李慧芬

(山东中医药大学，山东济南250355)

荷叶为睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn．的干燥叶，为临床常用中药，始载于唐· 《食疗本草》。荷叶的炮制始载于唐· 《外台秘要》的“炙”［1］，古代应用的炮制方法尚有炒令黄、炒香、炒焦、烧灰存性、焙等。现代主要有煅炭［2］和炒炭法［3］，尚有酒炖法［2］。关于荷叶的炮制作用，清· 《得配本草》中明确指出荷叶“活血生用，止血炒焦用”。《中国药典》2010年版载:“荷叶清暑化湿，升发清阳，凉血止血。荷叶炭收涩化瘀止血，用于多种出血证及产后血晕”［2］。也有认为，清热解暑宜生用，散瘀止血宜炒炭用［4］。生荷叶现临床主入降血脂和活血化瘀剂，如治高脂血症属痰浊挟瘀的荷丹片、治高血压和动脉硬化的艳友茶、治高血脂症和动脉硬化的通脉降脂片(《卫生部颁药品标准》)。荷叶炭主入止血剂，且以丸散剂为主，如《中国药典》2010年版的荷叶丸及《卫生部药品标准》的犀角地黄丸、十灰丸、十灰散、治红丸均含有荷叶炭。关于荷叶饮片的止血作用，目前研究仍比较薄弱，仅见有人以小鼠凝血时间为指标，对荷叶生品和煅炭品的止血作用进行比较，结果荷叶生、炭品水煎液均有止血作用，制炭后止血作用增强［5］，但荷叶不同制炭方法止血作用有何差异及其止血机理尚未见报道。本实验比较荷叶生品、炒炭品和煅炭品醇水双提物对正常大鼠血浆活化部分凝血活酶时间 (APTT)、凝血酶原时间 (PT)、凝血酶时间 (TT)和纤维蛋白原(FIB)水平的影响，初步探讨其止血作用机制。

1 实验材料

1.1 动物 SD大鼠，雌性，体质量 (200±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号:scxk(京)2002-0003。适应性饲养1周后进行实验。

1.2 药品与试剂荷叶片购自山东百味堂中药饮片有限公司，经山东中医药大学中药鉴定教研室周凤琴教授鉴定为睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn．的干燥叶经加工而成的丝状片，产地山东。炒荷叶炭:按文献［3］方法依法制备，得率73.8%。煅荷叶炭:按文献［2］方法依法制备，得率70.3%。

枸橼酸钠，天津金汇太亚化学试剂有限公司(批号20110407);活化部分凝血活酶时间测定试剂盒 (APTT、批号20110915)、凝血酶原时间测定试剂盒 (PT、批号20110915)、凝血酶时间测定试剂盒 (TT、批号20110915)、血浆纤维蛋白原测定试剂盒 (FIB、批号20110915)，均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器 AYW8000半自动凝血分析仪，南京瑞麦科技开发有限公司;LDZ4-0.8离心机，北京医用离心机厂;78-1磁力加热搅拌器，金坛市杰瑞尔电器有限公司。

1.4 供试品溶液的制备荷叶炭按临床十灰散用量9 g计算，实验大鼠按临床用量20倍给药，即3 g/kg。取炒荷叶炭粗粉90 g、煅荷叶炭粗粉90 g、荷叶片粗粉122 g(按得率计算，相当于炒荷叶炭90 g)，分别加15倍量80%乙醇，80℃加热回流提取2次，每次1 h;合并提取液，60℃减压回收乙醇至近干得醇提物，药渣加15倍量水，80℃加热回流提取1 h，提取液60℃减压回收水至近干得醇提物;合并醇提物和水提物，加适量蒸馏水研磨混匀并稀释至300 mL，即得质量浓度为0.3 g/mL的混悬液，临用前用磁力搅拌器搅匀。

2 方法与结果

2.1 大鼠分组及给药方法取SD大鼠32只，雌性，体质量 (180±20)g，随机分为4组，每组8只，分别为空白对照组 (蒸馏水组)、生荷叶醇水双提物组、炒荷叶炭醇水双提物组、煅荷叶炭醇水双提物组。各供试品溶液分别按10 mL/kg的剂量灌胃，每日灌胃给药1次，连续给药7 d。

2.2 APTT、PT、TT、FIB的测定［6］于第7天灌胃1 h后腹主动脉取血5mL，按9∶1比例与3.2%枸橼酸钠溶液混匀，以3 000 r/min离心15 min，分离血浆备用。按各指标试剂盒的要求进行APTT、PT、TT和FIB的测定，采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行成组比较t检验及方差分析，实验数据以¯± s表示，结果见表1～表2。

表1 荷叶不同炮制品提取物对正常大鼠APTT、PT、TT的影响Tab.1 Influence of differently processed Nelumbinis Folium extracts on normal rats APTT，PT，TT

表2 荷叶不同炮制品提取物对正常大鼠血浆纤维蛋白原(FIB)的影响Tab.2 Influence of differently processed Nelumbinis Folium extracts on normal rats fib level in blood plasma

研究结果表明，与空白对照组比较，生荷叶醇水双提物可明显缩短PT(P＜0.05)，但对APTT、TT和FIB水平无明显影响;炒荷叶炭和煅荷叶炭醇水双提物均可明显缩短APTT(P＜0.001)、PT(P＜0.01)，增加FIB水平 (P＜0.05)，尤以对APTT影响最为显著，但对TT无明显影响;与生荷叶组比较，炒荷叶炭和煅荷叶炭醇水双提物均能明显缩短APTT(P＜0.001)，增加FIB水平 (P＜0.05)。

3 讨论

3.1 血液凝固过程十分复杂，可分为内源性和外源性两个系统，大致可分为三个阶段，即形成凝血活酶激活剂、凝血酶原转变成凝血酶、纤维蛋白原转变成纤维蛋白。APTT主要反映内源性凝血途径凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的水平［7］;PT可反映外源性凝血途径的有关因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ的水平。TT主要反映纤维蛋白原转变为纤维蛋白的时间及内、外源共同性凝血途径是否存在抗凝和纤溶亢进。FIB即为凝血因子Ⅰ，是通过对纤溶系统的影响反映凝血效果。本研究结果显示，荷叶生、炭品均具有止血作用，经炒炭和煅炭后止血作用增强，但不同制炭方法对荷叶炭的止血作用无明显影响;生荷叶通过影响大鼠外源性凝血系统发挥止血药效;而荷叶炭止血则通过影响大鼠内源性、外源性凝血系统及纤溶系统共同作用所致，尤以对内源性凝血系统影响更为显著。

3.2 荷叶的制炭方法目前仍不统一，有炒炭和煅炭法两种。传统认为，荷叶质地疏松，炒炭易轻扬灰化，宜采用煅炭法制炭，现行药典仅收载煅炭法，但在《中国药典》2010年版收载的“荷叶丸”及《卫生部药品标准》的“十灰散”中均明确规定用炒炭法制炭。前期研究发现，荷叶炒炭品中槲皮素、金丝桃苷量均略高于煅荷叶炭［8-9］，二者的HPLC指纹图谱无明显差异，且炒炭法操作简便，药物受热均匀，温度可控，荷叶炒炭时只要炒制温度和时间适宜，并不易出现燃烧和灰化现象。而煅炭法操作复杂，只能少量加工，目前尚无适合大生产的闷煅设备［10］，且由于煅制时容器密封不能对药物进行翻动，煅锅底部宜出现太过现象，本研究结果表明，荷叶炒炭和煅炭品凝血四项指标均无明显差异，因此认为，荷叶以炒炭法制炭为宜。

3.3 荷叶中主要含有生物碱和黄酮类成分，荷叶总生物碱具有降血脂、抑菌等作用［11-12］，荷叶总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用［13］。前期研究表明，荷叶经炒炭和煅炭后荷叶碱损失殆尽，金丝桃苷量显著降低，槲皮素量显著升高［8-9］。有报道，槲皮素可显著缩短小鼠出血和凝血时间及大鼠血浆凝血酶时间［14］。荷叶制炭后止血作用增强，分析与制炭后生物碱、黄酮类成分含量变化密切相关。荷叶制炭止血机理及荷叶炭止血药效物质基础均有待深入研究。

［1］中华中医药学会．中医必读百部名著·外台秘要方［M］．北京:华夏出版社，2009:145.

［2］国家药典委员会．中华人民共和国药典:2010年版一部［S］．北京:中国医药科技出版社，2010.

［3］山东省卫生局．山东省中药炮制规范［S］．山东:山东人民出版社，2002.

［4］田代华．实用中药辞典［M］．北京:人民卫生出版社，2002:1530.

［5］顾瑶华，朱悦，廖立，等．荷叶炭饮片的止血作用研究［J］．西北药学杂志，2010，25(1):37-38.

［6］陈奇．中药药理研究方法学［M］．北京:人民卫生出版社，1994:1067-1068.

［7］李仪奎．中药药理实验方法学［M］．上海:科学技术出版社，2006:690.

［8］董春永，张学兰，李慧芬．炮制对荷叶中荷叶碱和槲皮素含量的影响［J］．中成药，2010，32(6):973-976.

［9］唐超，张学兰，徐鑫．荷叶炮制金丝桃苷含量变化研究［J］．山东中医药大学学报，2011，35(1):78-79.

［10］蔡宝昌．中药炮制学［M］．北京:中国中医药出版社，2008:247.

［11］黄阿根，施洪飞，韦红，等．荷叶黄酮和生物碱的提纯及调节血脂作用比较［J］．扬州大学烹饪学报，2006，2(3):23-25.

［12］唐裕芳，张妙玲，刘忠义，等．荷叶生物碱的提取及其抑菌活性研究［J］．广州食品工业科技，2004，20(2):51-52.