HPLC法同时测定胃复春片中蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丁素

蒋慧莲， 祝 明， 陈 勇， 李文庭

(1.浙江中医药大学药学院，浙江杭州310053;2.浙江省食品药品检验研究院，浙江杭州310004)

胃复春片具有健脾益气、活血解毒之功效，其主要组成为红参、香茶菜、枳壳［1］。临床上胃复春片用于胃癌前期以及慢性胃炎的治疗，胃复春片系纯中药制剂，长期使用安全可靠，毒副作用小，是治疗慢性萎缩性胃炎比较理想的药物［2-6］。香茶菜目前的标准多为地方标准，而各地的标准中对香茶菜的基源规定差异较大。经调研，目前市场上香茶菜实际流通与使用较多的为安徽及河南产的香茶菜，主要品种为蓝萼香茶菜。蓝萼香茶菜Rabdosia japonica(Burm．f．)Hara var．Glaucocalyx(Maxim．)Hara为唇形科植物，具有健胃消食、清热解毒、活血等作用及抗菌、抗癌和抗肿瘤等生物活性［7-12］。蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丁素均为蓝萼香茶菜的主要成分［13］，目前尚未有报道对胃复春片中香茶菜的相关成分进行测定，而香茶菜作为胃复春片的主要成分，为了更好地对胃复春片的质量进行控制，作者对胃复春片中香茶菜主要成分蓝萼甲素、乙素、丁素进行测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-20A高效液相色谱仪 (日本岛津);METILER AE240型电子天平。

1.2 试剂与试药 对照品:蓝萼甲素、蓝萼乙素及蓝萼丁素均为自制，纯度＞99%。样品:胃复春片10批，杭州胡庆余堂药业有限公司生产。甲醇、乙腈均为色谱纯;水为重蒸水;其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 kromasil C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为乙腈 (A)-甲醇(B)-水 (C)梯度洗脱，0～18 min，24%A，5%B，71%C;18～45 min，24% ～10%A，5%～50%B，71% ～40%C;45 min～51 min，10%～80%A，50% ～5%B，40% ～15%C;51 min～53 min，80% ～24%A，5%B，5% ～71%C;53 min～60 min，24%A，5%B，71%C;体积流量1 mL/min;检测波长232 nm;柱温30℃;进样量10μL，标准曲线法。对照品及供试品色谱图见图1。

2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丁素适量，加70%甲醇配置成质量浓度为48.68、32.96、30.56μg/mL的对照品溶液。

图1 胃复春片HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of W eifuchun Tablets

2.3 供试品溶液的制备 取样品 (批号1111247)适量，研细，取1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液25 mL，蒸干，加水15 mL溶解，用三氯甲烷振摇提取4次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，加甲醇溶解转移至10mL量瓶中并稀释至刻度，摇匀即得。

2.4 测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，计算，即得。

2.5 线性关系考察 分别精密称取蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丁素适量，加70%甲醇溶解并稀释成质量浓度为97.36、65.92、61.12μg/mL的混合对照溶液，精密量取0.5、1、2、3、5、10、15、20、25μL，注入液相色谱仪，以色谱峰峰面积(Y)为纵坐标，进样量 (X，ng)为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丁素在实验质量浓度内线性关系良好。见表1。

表1 蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丁素的线性关系Tab.1 Linearity of glaucocalyxin A，glaucocalyxin B and glaucocalyxin D

2.6 精密度试验 取混合对照溶液按2.1项下色谱条件连续进样6针，记录对照品峰面积，蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丁素峰面积RSD分别为0.3%、0.3%、0.4%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 取胃复春片供试品 (批号1111247)按2.3项下方法制备供试品溶液，在0、2、4、8、12、18、24 h进样测量峰面积，结果蓝萼甲素、蓝萼乙素及蓝萼丁素的峰面积RSD分别为1.2%、0.3%及0.1%，表明供试样品溶液在24 h内稳定。

2.8 重复性试验 取胃复春片供试品 (批号1111247)，按2.3项下方法同时制备6份供试品溶液进行测定，蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丁素的含有量RSD分别为1.2%、1.8%及1.8%，表明本方法重复性良好。

2.9 专属性试验 按胃复春片制备工艺及2.3项下供试品制备方法制备缺香茶菜的阴性样品溶液，以2.1项下色谱条件进行测定，结果蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丁素均未检测出。见图1。

2.10 加样回收率 称取已测定的供试品 (批号1111247)约0.5 g，共6份，分别加入适量蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丁素的混合对照品，按2.3项下方法制备供试品溶液。在2.1项色谱条件下进样10μL，计算加样回收率。见表2。

表2 加样回收率试验结果(n=6)Tab.2 Resu lts of recoveries(n=6)

2.11 样品测定 取10批供试品，按2.3项下供试品制备方法制备供试液并测得蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丁素的质量分数分别为0.31～1.01 mg/g、0.26 ～1.14 mg/g、0.24 ～0.96 mg/g。见表3。

表3 胃复春片中蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丁素测定结果(n=3)Tab.3 Contents of glaucocalyxin A，glaucocalyxin B and glaucocalyxin D in Weifuchun Tablets(n=3)

3 讨论

3.1 曾尝试用70%甲醇、乙醇、70%乙醇进行提取，结果效果均未有甲醇提取好，因此确定使用甲醇作为提取溶剂。超声时间15 min、30 min、45 min以及60 min比较，结果15 min的时候未提取完全，而45 min和60 min的提取效果和30 min相近，因此选择超声30 min进行提取。选择萃取溶剂时，对乙酸乙酯、三氯甲烷以及乙醚做比较，结果乙酸乙酯萃取后杂质较多，乙醚萃取效果较差，三氯甲烷萃取效果最佳，杂质少，因此选用三氯甲烷作为萃取溶剂。

3.2 曾尝试以乙腈-水、甲醇-水、乙腈-甲醇-水以一定比例进行等度洗脱，结果杂质干扰较严重，且未能将蓝萼甲素、蓝萼乙素以及蓝萼丁素进行较好分离，最后考虑使用乙腈-甲醇-水进行梯度洗脱，将3个物质进行了较好分离。

3.3 曾将色谱条件中的色谱柱换成SB C18柱以及月旭C18柱进行考察，体积流量也以0.9mL/min和1.1 mL/min的体积流量与本方法进行了比较，柱温考察了25℃以及40℃，结果表明蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丁素均能较好分离，而且不同色谱条件下含有量差异均在0.5%以内，表明本方法耐用性良好。

3.4 从10批胃复春片测定结果看，样品中均含有蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丁素，说明胃复春片现基本以蓝萼香茶菜作香茶菜投料，从测定结果来看，不同批次样品蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丁素的含有量差异较大，因此有必要对其进行质量控制。而本方法对蓝萼甲素、蓝萼乙素、蓝萼丁素进行测定准确度高，耐用性好，能作为控制胃复春片质量的方法。

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