肾素（前体）受体在ox－LDL激活人脐静脉内皮细胞ERK1／2通路的作用

胡欣妍

动脉粥样硬化类疾病是严重威胁人类健康的疾病，目前一 致认为，动脉粥样硬化的病理本质是动脉内膜的慢性炎症。动脉粥样硬化在各种危险因素如病毒、机械损伤、糖尿病等引起内皮细胞损伤或者功能失调，血管内膜产生一种过度的慢性炎性增生反应[1]。血脂异常，尤其氧化修饰低密度脂蛋白（ox－LDL）是最重要的致动脉粥样硬化危险因素。丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）是细胞内一条重要的信号转导通路，MAPK包括细胞外信号调节的蛋白激酶（ERK）、c－jun N 端激酶（JNK）／应激激活的蛋白激酶（SAPK）和P38。它们参与多种胞外启动信号的细胞内转导过程，具有调节细胞的生长、分化、凋亡的作用。肾素（前体）受体[（P）RR]是Nguyen等在2 0 0 2年克隆出的，（P）RR表达在各种细胞中，如神经细胞、肾小球系膜、单核细胞、心肌和平滑肌细胞[2－7]，由350个氨基酸组成，含有1个非糖基化且高度疏水的氨基末端，该区域与肾素／肾素前体的结合有关，还含有1个由20个氨基酸构成的尾部。本研究旨在观察ox－LDL对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的ERK1／2信号通路的激活及（P）RR的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 健康产妇脐带由大连市妇产医院提供。氧化低密度脂蛋白购自Sigma公司；Renin Receptor siRNA购自Santa公司；兔抗 人 p－ERK1／2 抗 体，ERK1／2 抗 体，β－actin购 自 BIOWORLD公司；RNAiso、RT－PCR试剂盒及引物购自TaKaRa公司；羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG二抗购自Invitrogen公司；siRNA Transfection Reagent购自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 人脐静脉内皮细胞的培养 无菌采集健康新生儿脐带，长约20cm，用PBS将其冲洗干净，向脐静脉中注入0.1%Ⅱ型胶原酶，收集消化液离心弃上清，收集细胞。当细胞生长至融合状态时，加入胰蛋白酶溶液进行传代，将2代～6代细胞用于实验。

1.2.2 实验分组及检测指标 不同浓度ox－LDL（0mg／L、25 mg／L、50mg／L、100mg／L、150mg／L）与 HUVECs共同作用15min。浓度为100mg／L的ox－LDL不同时间，即0min、15 min、3 0min、6 0min、1 2 0min，用 Western blot方 法 检 测p－ERK 1／2、ERK 1／2蛋 白 。RNA干 扰 对HUVECs表 达（P）RRmRNA的影响：空白组；RNA干扰组：siRNA分别转染HUVECs 2 4h、4 8h、7 2h；转染试剂组：转染试剂1处理HUVECs2 4h、4 8h、7 2h，用RT－PCR的方法检测（P）RR mRNA。（P）RR在ox－LDL激活 HUVECs表达ERK1／2通路的作用：空白组；奥美沙坦（10－5M）＋PD123319（10－4M）；奥美沙坦 （10－5M）＋PD123319（10－4M）＋ox－LDL 组；siRNA转染＋奥美沙坦（10－5M）＋PD123319（10－4M）组；siRNA转染＋奥美沙坦（10－5M）＋PD123319（10－4M）＋ox－LDL组；转染试剂＋奥美沙坦（10－5M）＋PD123319（10－4M）＋ox－LDL组。用 Western blot方法检测p－ERK1／2、ERK1／2蛋白。

1.2.3 RT－PCR方法 提取HUVECs的RNA，逆转录合成cDNA（P）RR上游 PCR引物序列：5′－ATTGGCCTATACCAGGAGAG－3′；（P）RR 下 游 PCR 引 物 序 列：5′－TTCCCCATAACGCTTC CCAA－3′。进行PCR扩增：取PCR产物用琼脂糖凝胶电泳，然后凝胶成像仪成象。

1.2.4 蛋白质印迹 提取各组HUVECs总蛋白，在SDS凝胶上电泳，转入硝酸纤维素膜，加入兔抗人p－ERK1／2、ERK1／2抗体，4℃孵育过夜。充分洗膜后加入羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG二抗，37℃3h，充分洗膜后，加入ECL反应体系，曝光显影。

2 结 果

2.1 不同浓度ox－LDL对HUVECs的ERK1／2通路磷酸化的影响 25mg／L～150mg／L的ox－LDL均能引起 HUVECsERK1／2信号通路的磷酸化增加，以浓度为100mg／L的ox－LDL作用最强。详见图1。

图1 不同浓度ox－LDL对HUVECs的ERK1／2通路磷酸化的影响

2.2 ox－LDL（100mg／L）不同时间对 HUVECs的 ERK1／2通路磷酸化的影响 ox－LDL引起HUVECs的ERK1／2通路磷酸化增加，从5min开始增加，15min达高峰，此后开始下降。详见图2。

图2 ox－LDL（100mg／L）不同时间对 HUVECs的ERK1／2通路磷酸化的影响

2.3 siRNA转染 HUVECs对 HUVECs表达（P）RRm RNA的影响 siRNA转染HUVECs，可明显减少HUVECs表达（P）RRm RNA，以72h作用最明显。详见图3。

图3 siRNA转染HUVECs对HUVECs表达（P）RRm RNA的影响

2.4 RNA干扰（P）RR对HUVECs的ERK1／2通路磷酸化的影响 在用奥美沙坦和PD123319阻断AT1和AT2受体的情况下，ox－LDL 引 起 HUVECs的 P－ERK1／2增 加，RNA 干 扰（P）RR表达后，可以明显抑制ox－LDL可引起HUVECs的P－ERK1／2增加，说明（P）RR可以不依赖于血管紧张素Ⅱ，参与激活HUVECs的ERK1／2通路。详见图4。

图4 RNA干扰（P）RR对HUVECs的ERK1／2通路磷酸化的影响

3 讨 论

在MAPK家族中，人们发现得最早、研究得最透彻的是ERK通路。多种刺激因素，如血栓素A2、血管紧张素Ⅱ、转化生长因子等都可激活ERK。通过磷酸化激活转录因子，将来自细胞外刺激信号传导至细胞核内，调节相应基因的表达，与细胞分化、细胞凋亡、组织入侵和转移有关。P（RR）是肾素、肾素前体的功能性受体，不但能够与肾素、肾素前体结合，还可介导生物学功能。肾素与（P）RR结合可使肾素的活性增加为游离肾素的4～5倍。肾素前体与（P）RR结合会引起肾素前体分子构象发生改变而被激活，同时增加了血管紧张素－Ⅰ的产生，并可直接激活细胞内信号转导通路，如MAP激酶的ERK1／2和P38信号转导通路、热休克蛋白27激酶、PI3K－P85[8]等通路，调节某些基因的表达，进而导致细胞纤维化、生长和重塑。

本实验用奥美沙坦和PD123319阻断血管紧张素Ⅱ的AT1和AT2受体，排除了ox－LDL、肾素、肾素前体通过使血管紧张素Ⅱ产生增加，进而作用于其受体而发挥作用。结果发现，siRNA（P）RR转染 HUVECs72h，可以明显抑制（P）RRmRNA 的表达。并且抑制了ox－LDL对HUVECs的ERK1／2信号通路的激活。这说明（P）RR参与了ox－LDL激活HUVECs的ERK1／2通路。推测ox－LDL在增加HUVECs表达肾素、肾素前体，进而肾素、肾素前体作用于（P）RR激活 HUVECs的ERK1／2通路。抑制（P）RR的表达，可以有效抑制内皮细胞的ERK1／2同路的激活，这为抑制ox－LDL引起的内皮细胞的ERK1／2通路的激活，提供了一个新的治疗方法。

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