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血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的表达在原发性肝细胞癌中的诊断价值

2013-09-13姜胜莹曹建彪范公忍

解放军医药杂志 2013年4期
关键词:蛋白聚糖肌醇磷脂

姜胜莹,曹建彪,范公忍

原发性肝细胞癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)是临床常见恶性肿瘤之一,发病率和病死率均较高[1-2],对其早发现、早诊断以及早治疗具有重要意义。研究证实,磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3,GPC-3)与原发性肝细胞癌的发生、发展以及诊疗密切相关[3-5],其诊断敏感性和特异度较甲胎蛋白(alpha-Fetoproteins,AFP)均有增高,被认为是一种新型重要的HCC肿瘤标记物[6-7],二者联合检测可提高HCC早期诊断率[8]。有研究发现,GPC-3与HCC的分化程度及转移复发有关[9],也有研究表明GPC-3表达与肿瘤病理分级和临床分期有关[10],本文旨在探讨GPC-3对HCC的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2011年1月—2012年7月北京军区总医院全军肝病治疗中心住院的HCC 59例为HCC组,均符合2011年版《原发性肝癌诊疗规范》中诊断标准,并经病理学、影像学确诊,入院前未接受放疗、化疗、免疫治疗或中药治疗等。男51例,女8例;年龄36~79岁。选择同期该院确诊的肝硬化住院患者35例为肝硬化组,均符合2000年中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会修订的《病毒性肝炎防治方案》标准,男26例,女9例;年龄30~76岁;肝功能分级均与HCC组在同一水平。选择同期该院健康体检中心体检者30例为健康对照组,男17例,女13例;年龄27~66岁;经检查各型肝炎病毒标志物及AFP均为阴性,无心、肝、肺、肾功能异常。3组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 材料与方法 受检者在入院后均清晨空腹采集静脉血3 ml,不抗凝,1000 r/min离心5 min,留取血清转移至另一清洁的EP管内放置于-70℃冰箱内保存,统一检测。血清GPC-3测定采用酶联免疫定量法检测,ELISA试剂盒购自美国R&D公司(编号为DY2119),计算平均光密度值(optical density,OD值),通过使用计算机软件产生四参数逻辑(4-PL)曲线拟合,从而创建GPC-3浓度的标准曲线,根据OD值计算每个样品中GPC-3的含量;AFP检测采用电化学发光免疫法测定,使用同型配套试剂,检测值>200 ng/ml者为阳性,各项操作均按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,成组资料组间比较采用t检验,计数资料以率(%)表示,采用Pearson χ2检验,影响因素采用Logistic回归模型分析,α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 GPC-3浓度标准曲线 以GPC-3标准品连续2倍逐级稀释浓度为横坐标,以光密度结果检测值为纵坐标,绘制标准曲线,直线回归方程为:Y=0.0003X -0.0014,相关系数 r≈1,见图1。

图1 酶联免疫定量法检测血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3浓度标准曲线

2.2 血清中GPC-3和AFP浓度检测 HCC组血清GPC-3表达水平和AFP含量均明显高于肝硬化组及健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05),肝硬化组血清GPC-3表达水平和AFP含量与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 3组血清中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、甲胎蛋白浓度检测结果(±s)

表1 3组血清中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、甲胎蛋白浓度检测结果(±s)

注:与肝硬化组及健康对照组比较,aP<0.05

组别 例数 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(pg/ml)甲胎蛋白(ng/ml)原发性肝细胞肝癌组 59 938.00 ±404.67a285.64 ±452.39a肝硬化组 35 338.00 ±238.00 4.54 ±5.39健康对照组30 304.67 ±204.67 1.97 ±1.52

2.3 血清GPC-3浓度检测的ROC曲线 根据上述3组人群GPC-3检测结果绘制特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC),见图 2。曲线下面积为0.912,95%可信区间为0.859~0.965,当取GPC-3为601.33 pg/ml是判断HCC的界值时,GPC-3诊断 HCC的敏感性为89.3%,特异度为90.8%,阳性预测值为 89.3%,阴性预测值为86.8%。以200 ng/ml为 AFP阳性界值,HCC组AFP阳性率为32.2%(19/59),以601.33 pg/ml为GPC-3阳性界值,HCC组GPC-3阳性率为84.7%(50/59)。AFP与GPC-3联合检测可使HCC的确诊率提高至88.1%(52/59)。

图2 血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3浓度检测的ROC曲线

2.4 HCC组GPC-3表达与AFP水平及临床参数的Logistic回归模型分析 对HCC组血清中GPC-3表达水平为因变量(Y=1,GPC-3>601.33 pg/ml;Y=2,GPC-3≤601.33 pg/ml),以年龄、性别、有无门脉癌栓、有无远处转移、TNM分期、Child-pugh分级、有无HBsAg感染、AFP水平、肿瘤最大直径为自变量,进行Logistic回归模型分析,结果显示GPC-3表达与年龄、性别、有无门脉癌栓、TNM分期、Child-pugh分级、有无HBsAg感染、AFP水平及肿瘤最大直径均无相关性(P>0.05),而仅与有无远处转移有高度相关性(P<0.05),见表2。

表2 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3表达与甲胎蛋白水平和临床参数Logistic回归模型分析

3 讨论

GPC-3属于膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)超家族成员,主要通过糖基(GPI)锚定于细胞膜上[11],GPC-3基因位于人类的X染色体(Xq26)上,全长大约900 kb,其编码的含580个氨基酸的核心蛋白质前体可裂解生成1个40 kDa氨基(N)端蛋白和1个30 kDa膜结合羧基(C)终端蛋白,2个硫酸乙酰肝素(HS)糖链连接到C-末端,参与信号间的传递[12],通过多种信号通路直接调控肿瘤细胞增殖、分化、黏附及转移等过程[13-15],尤其在HCC组织中发挥了重要作用[16-17],GPC-3在核心蛋白下游富含半胱氨酸结构区的下端,即第358位精氨酸和359位丝氨酸处可以被酶切割而分成2段,使N-端约含40 kDa的GPC-3蛋白成为可溶性蛋白片段而分泌入血,这是外周循环血清能够检测GPC-3的分子生物学基础。

本研究采用酶联免疫定量法检测GPC-3标准品浓度,结果显示,本实验的标准曲线近似直线,相关系数接近1,说明曲线拟合度较好,实验结果具有较好的重复性。同时检测了59例HCC、35例肝硬化及30例健康体检者中 GPC-3表达水平,发现HCC组血清GPC-3呈现高表达,而在肝硬化组及健康对照组呈现低表达甚至无表达。本研究采用ROC曲线法,标定GPC-3为601.33 pg/ml是诊断HCC的阳性界值,敏感性为 89.3%,特异度为90.8%,阳性预测值为 89.3%,阴性预测值为86.8%;HCC组AFP阳性率为32.2%,GPC-3阳性率为84.7%,AFP与GPC-3联合检测可使HCC确诊率提高至88.1%。研究发现,HCC患者血清GPC-3浓度明显高于肝炎后肝硬化、慢性肝炎等肝脏良性病变患者及健康对照组[18-20]。江枫等[21]应用ELISA检测计算发现当以3.19 μg/ml为诊断界值时,GPC-3诊断HCC的敏感性和特异度分别为85.4%及98.9%,进一步发现,GPC-3能显著提高小肝癌与肝硬化结节的鉴别诊断。吴诗品等[22]研究显示HCC组血清GPC-3浓度明显高于肝内良性占位组和正常对照组,根据 ROC曲线,取412.6 pg/ml为诊断界值时,GPC-3诊断HCC的敏感性和特异度分别为63.2%和89.3%。付顺军等[23]研究结果显示,HCC患者血清中 GPC-3浓度明显高于肝硬化患者和健康者,而肝硬化患者和健康者比较差异无统计学意义,诊断HCC的敏感性和特异度分别为88.1%和85.9%。Zhang等[24]利用磁粒子为基础的酶联免疫化学发光技术(CLEIA)测定正常肝脏、肝硬化、继发性肝癌及原发性肝癌患者血清中GPC-3的浓度,发现GPC-3在原发性肝癌患者的血清中高表达,而在正常成人、肝炎、肝硬化中无表达或低表达,可有效的诊断原发性肝癌,是HCC的一个重要且有效的肿瘤标记物。因此我们认为GPC-3有可能成为替代AFP,或更有价值的肝癌标志物分子。

本研究进一步结合临床参数进行Logistic回归模型分析后发现,GPC-3表达仅与有无远处转移呈高度相关,而有无远处转移和HCC的预后密切相关,因此我们推测GPC-3的高表达在某种程度上与HCC预后相关。Yao等[25]研究发现HCC患者血清中AFP及GPC-3蛋白分布量不具有相关性,本研究结果与该文献报道一致。王攀等[26]研究显示,血清中GPC-3和AFP的表达均与HCC的临床分期、病理分级、肝硬化程度有关。也有研究发现肝癌患者GPC-3 mRNA的表达与血清AFP水平、门脉癌栓、肝内转移、HBsAg及年龄等不相关,而与肿瘤直径有关[27]。不同学者得出不同结论,GPC-3的表达与HCC预后的关系尚无明确结论,期待更多相关研究进一步证实。

综上所述,GPC-3在HCC诊断中有较高的敏感性和特异度,尤其是在AFP阴性的HCC中,可成为诊断HCC重要的肿瘤标志物之一,其表达与HCC有无远处转移有关,由于本文观察例数较少,有关机制和实验结论尚需进一步深入研究。

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