三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）Perlucin蛋白原核表达条件的优化及表达产物的鉴定

林静云 白志毅 李家乐

三角帆蚌（Hypriosis cumingii）隶属双壳纲（Bivalvia）、蚌科（Unionidae）、帆蚌属（Hypriosis），是我国重要的淡水育珠蚌，主要分布于洞庭湖、太湖和鄱阳湖等大中型湖泊及其流域中［1］。自1979年人工繁殖成功，三角帆蚌已成为我国最重要的经济淡水珍珠蚌［2］。目前我国淡水珍珠年产量达1 800多吨，占世界淡水珍珠总产量的95％以上，占我国珍珠总产量的98％以上［3］，其中超过90％的淡水珍珠产自于三角帆蚌［4］，但产值仅占世界10％。这种产量与产值强烈反差的现象主要是由我国珍珠质量不高所致［5］，从而严重制约了产业的健康发展。因此寻找提高珍珠质量的新措施，尤其是运用生物学技术手段，是珍珠产业发展的迫切需求。而建立提高珍珠质量的新的生物学措施则必须阐明珍珠的形成机理，目前对于珍珠形成机理的研究主要集中在贝壳上，这是因为贝壳和珍珠在微观结构和化学组成上被认为是相同的物质［6］。

贝壳由大约95％的文石和5％的有机大分子复合而成，其中有机大分子包括基质蛋白和其他的一些生物高聚物［7］。基质蛋白虽然所占组分很少，但它不仅能够参与有机珍珠层框架的构建，决定碳酸钙晶体的多型构象，还控制着文石晶体的成核与生长［8，9］。基质蛋白在外套膜中的表达与其在贝壳中的分布相对应，具有区域化的特点。外套膜边缘分泌的基质蛋白参与了棱柱层的形成，为棱柱层基质蛋白；外套膜中央分泌的基质蛋白主要参与珍珠层的形成，为珍珠层基质蛋白。根据基质蛋白在贝壳中的分布和外套膜中表达的区域性的特点，可以明确所发现的基质蛋白的分类和功能。例如，MSI60在外套膜中部特异性地表达，是贝壳珍珠层基质蛋白，参与珍珠层的形成；MSI31特异性地表达在外套膜的边缘，是棱柱层基质蛋白，参与棱柱层的形成［10］；nacrein基因在外套膜的中部与边缘均有表达，属于两者共有的基质蛋白［11］。

Perlucin基质蛋白是从鲍的珍珠层中最先分离得到的，属于珍珠层基质蛋白，具有提高碳酸钙晶体形成速度，修饰晶体形态等功能。它不仅是珍珠层的组成部分，也是对贝壳和珍珠的形成具有重要功能的大分子［12，13］。然而在淡水珍珠蚌中对于perlucin基因的研究却未见报道，为了进一步了解Perlucin蛋白对珍珠形成的作用，本试验构建Perlucin蛋白原核表达质粒，优化该表达质粒的诱导条件，并通过Western blot技术进行鉴定。以期为进一步研究三角帆蚌Perlucin蛋白的生理功能、结构特点和作用原理提供基础理论。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞DH5α、BL21（DE3）、异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和硫酸卡纳霉素购自上海天根生化科技公司。限制性核酸内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和T4 DNA连接酶购自NEB公司。NC膜购自Bio-Rad公司。鼠抗Histag单抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG及DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。pMD19-T Vector与其他常规生化试剂均购自大连宝生物工程有限公司。原核表达载体pET-28a为本实验室保存。PCR引物均由上海生工生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 perlucin基因ORF的克隆及重组表达质粒pET-28a-Hcperlucin的构建 根据本实验室已克隆得到的三角帆蚌perlucin基因全长cDNA序列（GenBank登录号：KC436008），利用Primer Premier 5软件设计一对特异性引物。其中上游引物PerF为：5'-CGGGATCCATGGATTTCTCATTGATATTCGT-3'（下划线为BamHⅠ酶切位点），下游引物PerR为：5'-CGCGAATTCCTAAGACCGTGCCTGACAGAT-3'（下划线为EcoRⅠ酶切位点，斜体为终止密码子）。以三角帆蚌cDNA第一条链为模板，用包含酶切位点的特异性引物PerF、PerR扩增三角帆蚌perlucin基因ORF的全长。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃ 30s，59℃ 1min，72℃ 1min，共 30 个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物纯化后连接到pMD19-T Vector后转化E.coli感受态细胞DH5α，摇菌提取质粒，用限制性酶BamHⅠ和 EcoRⅠ分别双酶切处理带有目的片段的pMD19-T和pET-28a。酶切片段与线性化质粒pET-28a连接并转化E.coli感受态细胞BL21（DE3）。使用菌落PCR筛选阳性克隆，进一步通过双酶切鉴定。同时将阳性克隆测序鉴定，以确定插入序列正确。

1.2.2 细菌培养及重组蛋白表达 将经过鉴定过的工程菌接种于4mL LB液体培养基（含硫酸卡那霉素50μg/mL）中，37℃振荡培养过夜。按1∶50的比例扩大培养，至OD600介于0.4-0.6，加入终浓度1mmol/L IPTG 37℃诱导表达4h，取20mL菌液离心收集菌体，超声破碎，离心后取上清，沉淀用8mol/L的尿素溶解，以SDS-PAGE（浓缩胶浓度 50mg/mL，分离胶浓度12mg/mL）分析重组蛋白表达情况。同时设置未诱导的工程菌作为阴性对照。

1.2.3 最佳诱导温度试验 取过夜培养的转化菌液BL21按1∶50的比例扩大培养，至OD600介于0.4-0.6，加入终浓度为1mmol/L IPTG诱导表达。在30℃、37℃和42℃条件下诱导4h后各取20mL菌液离心收集菌体，超声破碎，对离心后的沉淀以SDS-PAGE分析目的蛋白表达的最佳温度条件。

1.2.4 最佳诱导时间试验 细菌培养方法同上，当OD600介于0.4-0.6时，在“1.2.3”确定的目的蛋白表达的最佳温度条件下加入终浓度为1mmol/L IPTG，分别于诱导0、2、4、6、8、10和12h后各取20mL菌液，以SDS-PAGE分析目的蛋白的表达量，确定目的蛋白表达的最佳诱导时间。

1.2.5 最佳诱导剂浓度试验 细菌培养方法同上，在“1.2.3”和“1.2.4”确定的最佳诱导温度和诱导时间条件下，加入不同浓度的IPTG，使其终浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5和2.0mmol/L 7个浓度梯度，以SDS-PAGE分析目的蛋白的表达量，确定目的蛋白表达的最佳IPTG诱导浓度。

1.2.6 Western blot分析鉴定 重组融合蛋白经SDSPAGE电泳后转至NC膜上。NC膜浸泡于封闭液中于室温放置1h后，用鼠抗His-tag单抗与之于4℃条件下反应过夜，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG，各步骤之间用含体积分数0.1％的Tween-20的磷酸缓冲液（TTBS）洗膜4次，每次10min，最后用二氨基联苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）显色液显色至有清晰的目的条带出现并拍照。

2 结果

2.1 perlucin基因原核表达载体的构建与鉴定

PCR扩增到约483bp的基因片段。将回收纯化的目的片段转入pMD19-T Vector后，构建pMD-19T-Hcperlucin重组质粒，对该质粒进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，将酶切产物中的目的片段与表达载体pET-28a连接，并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，构建pET-28a-Hcperlucin重组表达质粒，菌落PCR扩增出与预期结果483bp大小一致的特异性条带（图1-A）。对该重组表达质粒进行双酶切鉴定，也得到一条长约483bp的条带（图1-B），与预期大小一致。对酶切鉴定正确的阳性克隆进行测序，序列比对结果正确，表明原核表达载体pET-28a-Hcperlucin已构建成功。

图1 重组质粒 pET-28a-Hcperlucin菌液PCR鉴定（A）及双酶切鉴定（B）

2.2 三角帆蚌perlucin重组融合蛋白在大肠杆菌中的表达及表达条件优化

2.2.1 重组融合蛋白表达 收集的工程菌经超声破碎，分离上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳分析。

与未经诱导的工程菌相比，经过IPTG诱导后，菌体蛋白沉淀泳道处多出1条明显条带，其大小与预测的重组蛋白分子量相近，约21kD，而上清泳道则无相应的条带（图2），表明重组融合蛋白主要以包涵体形式存在。

图2 pET-28a-Hcperlucin重组蛋白的表达分析

2.2.2 最佳诱导温度 在其他条件一致的情况下，不同诱导温度下重组融合蛋白的表达量的结果（图3）表明，37℃条件下蛋白表达量明显高于42℃下的表达量，而30℃条件下的表达量很低。所以该重组融合蛋白的最佳诱导温度是37℃，并且以包涵体形式表达。

2.2.3 最佳诱导时间 诱导时间是影响重组融合蛋白表达量的重要因素之一，在其他条件一致的情况下，经不同时间（0-12h）诱导后，诱导时间在6h以内，重组融合蛋白的表达量随着时间的延长而增高，但是随着诱导时间的延长，重组融合蛋白表达量呈现下降趋势（图4）。这表明长时间诱导不但不能提高重组蛋白表达量，还使表达量下降，故该重组融合蛋白的最佳诱导时间是6h。

图3 不同温度诱导表达的SDS-PAGE分析

图4 不同时间诱导表达的SDS-PAGE分析

2.2.4 最佳诱导浓度 在其他条件一致的情况下，不同浓度的IPTG（0.1-2.0mmol/L）均可明显诱导重组融合蛋白的表达。浓度在0.1-1.0mmol/L的IPTG诱导的重组融合蛋白表达量变化不大，但在1.5mmol/L和2.0mmol/L的浓度下，表达量明显下降（图5）。由于高浓度IPTG不利于细菌生长，因此该重组融合蛋白的IPTG最佳诱导浓度是0.1mmol/L。

2.3 重组融合蛋白的Western blot鉴定

在优化的表达条件下，对重组融合蛋白进行Western blot分析（图6）显示，重组融合蛋白可与His-tag单克隆抗体结合，表现出与重组融合蛋白大小一致的条带，结合pET-28a-perlucin 质粒的测序结果可推断，已成功表达三角帆蚌Perlucin蛋白。

图5 不同IPTG浓度诱导表达的SDS-PAGE分析

图6 用His-tag单克隆抗体进行Western blot分析

3 讨论

由于大肠杆菌具有易于培养、繁殖快、表达量高、成本低、易纯化、遗传背景清楚等优点，因此以大肠杆菌为载体的原核表达系统目前被广泛采用，成为高效表达研究的首选体系，其中BL21是应用最广的宿主菌［14］。pET-28a载体的N、C端带有Histag，有利于表达蛋白纯化和鉴定，且不影响重组融合蛋白的结构和功能，是抗原蛋白表达常用载体。因此本研究选用pET-28a为原核表达载体，将三角帆蚌perlucin基因的ORF序列连接到载体上，导入大肠杆菌BL21中，成功获得pET-28a-Hcperlucin重组质粒，并通过对诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度的优化，提高了蛋白的表达量。同时根据载体上的6个His标记，通过与His-tag单克隆抗体结合进行Western blot鉴定蛋白，确认所得蛋白为目的蛋白。

试验结果表明，重组融合蛋白在37℃、诱导6h、IPTG浓度为0.1mmol/L的条件下能大量表达目的蛋白，但主要以包涵体的形式存在。重组大肠杆菌在30℃时为最适表达温度，37℃为最适的细菌生长温度［15］。然而，在本试验中，重组蛋白在30℃的时候表达产物量远远低于37℃，而盘鲍中该重组蛋白在37℃同样能够得到较好的表达［16］，这说明重组蛋白最佳诱导温度可能受到插入目的基因的影响。诱导剂IPTG 会阻遏蛋白不能与操纵基因结合，使外源基因大量表达，但高浓度的 IPTG 诱导会阻碍蛋白的表达［17］。本试验的诱导结果同时说明长时间的诱导并不能进一步提高蛋白的表达量。而IPTG的浓度在1.0mmol/L的范围内也不会对重组融合蛋白表达产生较大影响。IPTG虽然对细胞没有毒害作用，但可以通过改变培养基的酸碱度，从而抑制细菌生长［18］。因此，在表达量相差不大的情况下，应选用浓度较低的IPTG进行诱导。Western blot结果显示，重组融合蛋白pET-28a-Hcperlucin可与鼠抗Histag单抗特异性结合，说明本研究获得了pET-28a-Hcperlucin表达产物。这为抗体制备、体外结晶试验、进一步探究Perlucin蛋白的生理功能、结构特点和作用原理提供了研究基础。

4 结论

将三角帆蚌perlucin基因序列连接到表达载体pET-28a中，IPTG诱导重组融合蛋白pET-28a-Hcperlucin在大肠杆菌中表达。重组融合蛋白pET-28a-Hcperlucin的最优表达条件为37℃、诱导6h、IPTG浓度为0.1mmol/L。通过与鼠抗His-tag单克隆抗体结合进行Western blot鉴定，确认所得为目的蛋白。

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