燕麦嗜酸菌鞭毛素的提纯及其活性检测

伍甜 刘莹 余超 边强 田芳 黄琼 陈华民 何晨阳

鞭毛素（flagellin）是细菌鞭毛的主要组分，不仅与鞭毛运动性有关，而且可以作为病原相关分子模式（PAMP）激发植物的免疫反应（PTI）［1］。其N 端有一个由 22 个氨基酸组成的保守肽段 flg22，通过与植物受体FLS2 的识别及其信号传导，最终诱导了拟南芥、番茄和烟草等植物的防卫反应［2-5］。同样，通过flg22与水稻受体 OsFLS2 的识别作用，也可引起水稻的防卫反应，但这种反应很微弱；而flg22或鞭毛素却能激发过表达OsFLS2的水稻悬浮细胞强烈的防卫反应［6］。燕麦嗜酸菌（Acidovorax avenae sub.avenae，简称Aaa）不亲和菌株N1141的鞭毛素能够引起水稻过敏反应，并伴随着大量H2O2的产生［7，8］。表明细菌鞭毛素作为PAMP对单子叶植物水稻PTI 的诱导作用机理比较复杂，有必要进行深入的探究。

本研究采用机械震荡、丙酮沉淀以及离子交换层析进行了蛋白提纯，并对其诱导水稻产生 H2O2的能力进行测定，旨在探索一种能够大量提纯的可行方法，并且获得提纯、有活性的鞭毛素蛋白，用于后续的水稻 PTI 机理的解析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 供试菌株：Aaa菌株NB001由中国检验检疫科学院赵文军研究员提供。水稻品种：日本晴（Oryza sativa ssp.japonica）由本实验室保存。Aaa 菌株NB001与水稻品种日本晴的存在不亲和互作关系。

1.1.2 主要试剂 KB 培养基（20g蛋白胨、10mL甘油、1.5 g K2HPO4、1.5gMgSO4·7H2O、1000mL H2O）；2×SDS 电 泳上样缓冲液（0.0615mmol/L Tris-HCl，pH6.8；1％ SDS，10％ 甘油，5％ β-巯基乙醇，0.002％溴酚蓝）；染色液（0.125g考马斯亮蓝R250、30mL甲醇、10mL冰乙酸、加H2O定容至100mL）；脱色液（30mL甲醇、10mL冰乙酸，加H2O 定 容 至100mL）；PBS（0.27 g KH2PO4、1.42 g Na2HPO4、NaCl 8g，KCl0.2 g、调节pH至7.4，加水定容至1L）；抗鞭毛素蛋白兔多克隆抗体（华大公司）；HRP标记的羊抗兔 IgG 抗体（华大公司）；Super Ecl发光液（北京普利莱基因技术有限公司）；DAB（AMRESCO公司）；蛋白Marker（预染蛋白质Marker Ⅲ）（天根公司）。

1.1.3 仪器和设备 台式恒温振荡器（太仓市实验设备厂）；离心机（BECKMAN公司）；震荡混匀器（VORTGX公司）；HPLC系统（GE公司）；阴离子交换柱（GE公司，5mL HiTrapTMSP HP）；阳离子交换柱（GE公司，5mL HiTrapTMQP HP）；垂直电泳槽（Junyi公司）；半干电转仪（Bio-Rad公司）；化学发光采集系统（GE公司）；水浴锅（PolyScience公司）；光学显微镜（OLYPUS 公司）。

1.2 方法

1.2.1 鞭毛素等电点和分子量预测 根据已测序的鞭毛素基因的编码序列，通过Primer 5.0翻译成为氨基酸序列，通过生物信息学网站 ExPASy（http：//web.expasy.org/compute_pi/）对 Aaa鞭毛素等电点（pI）、分子量进行预测。

1.2.2 菌体培养与蛋白粗提 接种细菌于4 L KB培养基中，在28℃下震荡（200r/min）培养24h。离心（7000r/min×20min，28℃），收集菌体沉淀；加玻璃珠与30-40mL的ddH2O于离心管中，振荡3min，收集上清为鞭毛素蛋白粗提液。

1.2.3 粗提液检测及纯化前处理 缓慢加入粗提液4倍体积的预冷丙酮，慢慢搅拌至析出大量蛋白，4℃放置过夜，沉淀蛋白。离心除去上清，收集蛋白后，静置于通风厨10min，待残余丙酮挥发。加入50mL ddH2O 重悬蛋白，留取100μL粗提液重悬物，采用5％浓缩胶（上层），12％分离胶（下层）进行SDS-PAGE电泳，检测粗提物纯度。其余粗提物用HCl调节至pH2.0，在常温下搅拌30min，此时鞭毛素蛋白从鞭毛上解离出来，形成解离液。将解离液分成等体积2份，分别稀释至300mL以降低盐浓度，并分别调节 pH至3.5和7.5，用滤膜（2.2μm）过滤，备用。

1.2.4 离子交换层析法纯化 使用高效蛋白纯化仪，分别通过阴、阳离子交换层析进行蛋白纯化。用浓度为15mmol/L的Tris-HCl，pH8.0的缓冲液作为A液（Start buffer），用1mol/L NaCl，通过加入HCl调节pH至7.0作为B液（elution buffer）。先用5倍柱体积的A液以5mL/min流速平衡层析柱，然后以3mL/min的流速，通过上样泵上蛋白样品（阳离子层析柱上pH为 3.5的粗提物样品，阴离子层析柱上pH7.5的粗提物样品）。然后用 2倍柱体积的A液，以5mL/min的流速冲洗层析柱。最后以线性方式洗脱蛋白（盐梯度使用NaCl的浓度由0-1mol/L），洗脱10个柱体积，用UV 214nm 监测洗脱峰，收集出峰的组份。

1.2.5 SDS-PAGE 检测和 Western blot 验证 取出峰组份，吸取20μL与等体积的2×SDS上样缓冲液，沸水浴中煮5min。处理好的样品经5％浓缩胶（上层），12％分离胶（下层）的SDS-PAGE凝胶电泳。一块胶用考马斯亮蓝染色2h，脱色液脱色12h，检测结果。另一块胶用半干转膜系统，在25 V恒压下转膜1h，所用的膜为PVDF膜；然后膜经过5％的脱脂奶粉室温封闭2h，PBS漂洗3次后，加入用PBS 1∶5000稀释的鞭毛素蛋白多克隆抗体，孵育2h，用PBS漂洗3次，加入HRP标记的羊抗兔IgG，孵育2h，使用PBS漂洗4次，最后加入Super Ecl发光液，采集化学信号成像。

1.2.6 生物活性检测 用DAB染色法进行蛋白活性检测。用浸润法将纯化蛋白（浓度0.3mg/mL）接种苗龄14d的水稻叶片，以15mmol/L的Tris-HCl（pH7.0）缓冲液作为对照。对接种部位叶组织取样，浸入含0.01％ Triton-X-100和1mg/mL DAB的水溶液中，同时真空30min。叶片在室温下过夜孵育，出现褐色-红色沉淀物质后，再将叶片浸入在95％乙醇∶乳酸∶苯酚（2∶1∶1）中，65℃孵育30min后，用50％乙醇冲洗，再用清水冲洗后，在光学显微镜下观察结果。

2 结果

2.1 鞭毛素等电点和分子量的预测

根据已经测序的Aaa鞭毛素的基因序列，通过生物信息学分析，预测该菌株的鞭毛素 pI 为 5.46，分子量为 49.37kD。

2.2 鞭毛素蛋白的提纯

通过加入玻璃珠剧烈震荡菌体的方法，使鞭毛与菌体分离。采用丙酮沉淀上清的方法，得到了大量的粗提物。SDS-PAGE电泳检测（图 1）发现，粗提物中鞭毛素蛋白含量较高，但是仍然含有较多的杂蛋白。

图 1 燕麦嗜酸菌鞭毛素粗提物 SDS-PAGE 电泳分析

在pH3.5或 pH7.5的条件下，粗提物中大量蛋白均能够结合到阳、阴离子层析柱上，洗脱峰较为单一（图 2）。

2.3 鞭毛素蛋白的检测

为了检测蛋白的纯化效果，对离子交换层析组份进行验证。SDS-PAGE结果（图 3）显示，阴、阳离子交换层析纯化后均能获得一条明显的蛋白条带（45kD左右）；相比较而言，阳离子交换层析纯化产物更纯，未发现其它蛋白。Western blot分析表明，经阴、阳离子交换层析纯化的为鞭毛素蛋白。

图 2 燕麦嗜酸菌鞭毛素离子交换层析洗脱峰

图 3 纯化后燕麦嗜酸菌鞭毛素的检测

2.4 鞭毛素蛋白的活性检测

通过 DAB 染色分析（图4）显示，纯化后的鞭毛素蛋白能引起水稻叶片产生大量的 H2O2，而缓冲液处理则没有 H2O2的产生，说明纯化得到的鞭毛素蛋白具有生物学活性。

图4 DAB 染色法检测鞭毛素蛋白诱导水稻叶片 H2O2 产生

3 讨论

由于细菌鞭毛素含量较低，在大规模提纯等方面一直存在一些困难。目前大多数报道采用超高速离心提纯法［9］，但由于受到仪器容量、离心条件的限制，提取量少，该法不适合大量提取。本研究对燕麦嗜酸菌鞭毛素提取和纯化方法进行了不同尝试，采用机械震荡、丙酮沉淀以及离子交换层析，成功地获得了纯化蛋白，为后续的大规模制备提供了技术支撑。

本试验发现：（1）通过玻璃珠机械震荡，使鞭毛更易从菌体上脱落；（2）针对鞭毛素结构较保守、耐受性较强的特点，通过加入丙酮破坏蛋白水化层，使粗提蛋白沉淀，从而有利于在酸性条件下蛋白解离；（3）鞭毛素（pI=5.46）无论带负或正电荷，都可分别结合到阴、阳离子交换层析柱上。但阳离子交换层析的蛋白组份单一，而阴离子交换层析的有较多的杂带。其可能的原因是，在pH=7.5条件下，粗提物中很多杂蛋白也带负电荷，与鞭毛素一起结合到阴离子层析柱上，且结合力相仿，从而进行线性洗脱时，两者一同被洗脱下来；而在pH=3.5条件下，鞭毛素带正电荷，能够结合到阳离子层析柱上，并且能够被洗脱下来；粗提物中杂蛋白在此pH条件，引发变性和空间构象变化，不能结合到阳离子层析柱上，或结合力过大，导致无法洗脱。用1mol/L NaOH对层析柱重生过程中，发现大量杂蛋白被洗脱出来（实验室资料）。

此外，本研究纯化的鞭毛素能引起水稻叶片产生H2O2，表明这种蛋白具有生物活性。鞭毛素是一种PAMP能够引起水稻的PTI。因此，这种纯化的、具有生物活性的鞭毛素蛋白可用于后续的水稻 PTI分子机理的解析。

4 结论

成功地组合利用机构震荡、丙酮沉淀和离子交换层析法，从Aaa中提纯了具有生物活性的鞭毛素蛋白。

［1］ 武晓丽, 陈华民, 吴茂森, 等.细菌鞭毛素对植物免疫防卫反应及其信号机制的激发［J］.植物保护, 2011, 37（3）：12-16.

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［3］ Robatzek S, Bittel P, Chinchilla D, et al.Molecular identification and characterization of the tomato flagellin receptor LeFLS2, an orthologue of Arabidopsis FLS2 exhibiting characteristically different perception specificities［J］.Plant Molecular Biology, 2007, 64（5）：539-547.

［4］ Meindl T, Boller T, Felix G.The bacterial elicitor flagellin activates its receptor in tomato cells according to the address-message concept［J］.The Plant Cell, 2000, 12（9）：1783-1794.

［5］ Hann DR, Rathjen JP.Early events in the pathogenicity of Pseudomonas syringae on Nicotiana benthamiana［J］.The Plant Journal,2007, 49（4）：607-618.

［6］ Takai R, Isogai A, Takayama S, et al.Analysis of flagellin perceptionmediated by flg22 receptor OsFLS2 in rice［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions, 2008, 21（12）：1635-1642.

［7］ Hirai H, Takai R, Iwano M, et al.Glycosylation regulates specific induction of rice immune responses by Acidovorax avenae flagellin［J］.Journal of Biological Chemistry, 2011, 286（29）：25519-25530.

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